基于Wnt通路的補腎養血法聯合DKK1-Ab治療對缺血型骨不連大鼠骨形成的影響

陳潮鋒 李 悅 直彥亮 姜自偉 石宇雄 梁錦成 劉 鋒 何德利

（1 廣州市番禺區中醫院（廣州中醫藥大學番禺中醫院），廣東 廣州 511400；2 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405；3 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

骨不連是創傷性骨折嚴重的并發癥之一，其治療仍是困擾廣大外科醫師和骨科醫師的難題。高齡與伴有多種基礎疾病為骨折和內固定術后骨折愈合帶來了巨大的挑戰[1]。在所有的骨折患者中愈合障礙的發生率為5%～10%[2]。其中有2%～5%的患者其骨折會在愈合過程中出現中止，進而引起骨折延遲愈合，甚至骨不連[3]。Wnt信號通路是與骨代謝關系密切的一個重要信號通路，與骨形成相關。DKK1（Dickkopf-1）是一種分泌型的糖蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路傳導的抑制因子[4]。DKK1中和抗體（DKK1-Ab），能有效拮抗DKK1在Wnt/β-catenin信號通路的抑制效應，促進骨形成，加快骨折的愈合速度[5]。既往研究表明，補腎養血方含藥血清可顯著促進沉默DKK1干預后細胞增殖和提高ALP活性，上調結締組織生長因子、骨保護素、骨橋蛋白的表達[6]。現代藥理學研究指出，補腎養血法可加快局部微循環修復，改善骨折端血液供應，增強炎性細胞的吞噬功能[7]。但補腎養血方聯合DKK1-Ab治療的效果如何還未見報道?；诖耍狙芯恐荚谔骄炕赪nt通路的補腎養血法聯合DKK1-Ab治療對缺血型骨不連大鼠骨形成的治療效果和作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 SPF級雌性SD大鼠48只，體質量180～220 g，鼠齡10～12周，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供[合格證SCXK（粵）2013-0034]。實驗動物分籠飼養，每籠最多5只。飼養室溫24～28 ℃，相對濕度為55%～65%，自由攝食水，每日照明12 h，黑暗12 h。

1.2 補腎養血方配制及DKK1-Ab干預 補腎養血中藥獨活寄生湯（獨活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、肉桂、細辛、秦艽、茯苓、防風、川芎、人參、甘草、當歸、芍藥、干地黃各6 g），水煎、過濾、濃縮為2 g/mL的生藥，灌胃前使用蒸餾水配制成20 mg/mL的濃度，每日1次灌胃。DKK1-Ab以25 mg/kg在骨折部位附近皮下注射，每周2次。

1.3 實驗試劑 生理鹽水、補腎養血中藥購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院；DKK1-Ab購于美國Abcom公司（批號ab196558）；戊巴比妥（批號20170325）購自國藥集團化學試劑有限公司；12 cm手術用剪、10 cm眼用有齒鑷購自上海金鐘醫療手術器械廠；其余試劑均購于廣州菲博生物科技公司。

1.4 實驗動物分組與造模 將48只SD大鼠隨機分為4組：骨不連對照組、DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組及聯合治療組。分組后進行造模，具體造模方法：第1步克氏針固定，行腹腔麻醉（5%水合氯醛，5 mL/kg），常規消毒鋪巾，取左下肢髕骨內側切口，縱行切開皮膚3 cm，將髕骨往外側牽拉使之脫位，顯露股骨髁間凹。用20號注射針自股骨髁間凹插入髓腔擴髓，然后取出注射針，逆行插入克氏針（直徑0.2 mm），從大轉子及皮膚穿出，克氏針遠端埋于股骨髁間骨皮質下，近端緊貼大轉子將尾部折彎剪除多余部分，隨后逐層閉合切口。第2步以改良Thamos法模擬高能量暴力所造成的股骨干閉合骨折，將動物右下肢外展內旋位固定于骨折造模裝置的鐵砧凹槽上（鐵砧凹槽間距為15 mm），造模支架柱下端骨刀壓于大腿中部，由助手提起500 g的砝碼至35 cm處，讓其自由落體撞擊股骨，致股骨中段骨折。期間允許自由負重、活動，分籠標準飼料喂養。第3步對大鼠右側股動脈進行結扎，術前使用Doppler血流儀測量雙下肢血流灌注情況，在股骨干造模后，取側臥位，常規剃毛備皮，用75%乙醇消毒左下肢皮膚，常規消毒鋪巾。用眼科鑷夾起皮膚，用手術刀從左側腹股溝至大腿內側作一1.0～1.5 cm的切口，在手術顯微鏡下依次分離各層組織，于血管鞘內充分分離股動脈、股靜脈和股神經，仔細游離股動脈，注意保護動脈，用2根8號可吸收線在股動脈遠近端分別結扎，上端緊靠股動脈分支，下端距上端約5 mm（圖1）。用眼科剪將兩結扎點間的股動脈剪斷，隨后縫合皮膚[8]。期間允許自由活動，術后3 d常規予以青霉素抗感染。造模成功后按分組每日進行藥物灌胃，持續灌胃7 d，DKK1-Ab皮下注射2次。

1.5 HE染色檢測成骨細胞數、破骨細胞數及血管數 分別于干預后第14、28日分次處死各組小鼠。取骨折周圍1 cm的骨段（均分3份），將一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，后將其置于10%的EDTA-2Na溶液脫鈣（每2～3 d更換1次脫鈣液）。待骨質松軟，針刺刀割無明顯阻力后表示脫鈣完成。以骨段縱軸為中心剖開骨段，經系列乙醇脫水、透明、浸蠟、剖面向下，低熔點石蠟包埋。用全自動切片機切成厚度約5 μm的蠟片，將蠟片分別展于載玻片上，做好標記，置于干燥箱中，42 ℃烤片48 h。石蠟切片經2次二甲苯脫蠟，梯度乙醇下行至水略洗，Harris蘇木精溶液染色15 min后水洗，藍化入1%伊紅水溶液1 min，用體積分數為95%的乙醇分色并上行至無水乙醇、二甲苯后，用中性樹膠封固。切片制作完成后用200倍光學顯微鏡觀察成骨細胞數、破骨細胞數及血管數。

1.6 免疫組化檢測VEGF、BMP-2含量 采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測VEGF、BMP-2含量，根據VEGF、BMP-2ELISA試劑盒說明書進行操作，石蠟包埋切片，常規脫蠟到水化后，滴加一抗，放置在4 ℃條件下12 h PBS沖洗3次，每次2 min；滴加二抗，在37 ℃條件下孵育30 min PBS沖洗3次每次2 min；使用DAB顯色試劑顯色。在400倍光學顯微鏡下檢測陽性信號灰度，采用BI-2000醫學圖像分析系統分析數據。

1.7 β-catenin 蛋白質印跡分析 如前述分4次，各組取1份（約250 mg）骨痂組織，加1 mL含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后抽提總蛋白。取出細胞，PBS洗滌2次，加入適量預冷的細胞裂解液，刮下細胞，將樣品轉移入Ep管中，冰上裂解細胞10～15 min，用超聲破碎儀破碎細胞，4 ℃高速離心15 min，取上清液。調整蛋白終濃度均為2 μg/μL，加入相同體積的緩沖液，混勻，沸水浴煮5 min，10%SDS-PAGE后轉膜，封閉。加入一抗（兔抗人p120ctn 抗體1∶1000，鼠抗人GAPDH 抗體1∶5000，鼠抗Flag 抗體1∶5000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應的二抗孵育PVDF膜2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL發光劑，顯影、定影，分析β-catenin 含量

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，組間差異采用ANOVA方差分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨組織學檢查 干預14 d后，除骨不連對照組外，各組骨折損傷區的成骨細胞和血管數增多，與補腎養血中藥治療組比較，DKK1-Ab治療組、聯合治療組成骨細胞數量均顯著升高（P＜0.05）；而補腎養血中藥治療組的血管數較DKK1-Ab治療組顯著升高（P＜0.05）。干預28 d后，與骨不連對照組比較，各組成骨細胞和血管數含量持續顯著升高（P＜0.05）；聯合治療組的血管數與補腎養血中藥治療組和DKK1-Ab治療組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，補腎養血中藥治療組較DKK1-Ab治療組的血管數顯著升高（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

圖1 組織學切片，箭頭所指為成骨細胞

表1 4組大鼠的組織學指標變化情況（）

表1 4組大鼠的組織學指標變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

2.2 補腎養血法對血清VEGF、BMP-2水平的影響 干預14 d后，與骨不連對照組比較，其余各組BMP-2、VEGF蛋白表達量均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；補腎養血中藥治療組較DKK1-Ab治療組顯著升高（P＜0.05），而聯合治療組VEGF表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。干預28 d后，與骨不連對照組比較，其余各組BMP-2、VEGF蛋白表達量均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；聯合治療組的BMP-2表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖2 組織學切片，箭頭所指為血管

表2 4組大鼠的生長因子變化情況（）

表2 4組大鼠的生長因子變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

2.3 補腎養血法對骨組織中β-catenin蛋白水平的影響 干預14 d后，與骨不連對照組相比，各組β-catenin蛋白表達相對較多，差異有統計學意義（P＜0.05），且聯合治療組較DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。干預28 d后，DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組、聯合治療組β-catenin蛋白表達量與骨不連對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯合治療組的β-catenin蛋白表達量與DKK1-Ab治療組、補腎養血中藥治療組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠的β-catenin蛋白變化情況（）

表3 4組大鼠的β-catenin蛋白變化情況（）

注：與骨不連對照組同期比較aP＜0.05；與DKK1-Ab治療組同期比較bP＜0.05；與補腎養血中藥治療組同期比較cP＜0.05。

3 討 論

在臨床上，缺少血液供應支持是導致骨折延遲愈合或骨不連的一個重要因素。在本實驗中，通過結扎大鼠的股動脈，對股骨中段使用三點沖擊法進行造模，而通過既往的預實驗，已經明確了該造模法接近臨床，通過這種造模方法可造成急性缺血的微環境而不損傷軟組織，可有效避免由于骨膜組織和骨髓的過度損傷而帶來的影響。骨不連在祖國醫學中歸屬到“骨虛”、“骨萎”范疇，系邪盛正衰、腎精耗傷，氣血兩虛不能運行而氣滯、血瘀所致，“虛”、“瘀”并存，本虛標實，故標本同治，才能相得益彰。肝腎兩臟，皆為要本，不可偏廢，肝主筋，主藏血，筋束骨，筋骨相連。由此從理論上確立了調補肝腎是促進骨折愈合的重要環節。陳士鐸言“骨傷必內動于腎，筋傷必內動于肝，腎不生髓則不能養骨，血不濡筋，則筋松而不能束骨”。獨活寄生湯出自唐?孫思遂《備急千金要方》。專為痹證日久，肝腎兩虧，氣血不足而設。癥見腰膝疼痛，肢節屈伸不利，或麻木不仁，畏寒喜溫，心悸氣短，舌淡苔白，脈象細弱等。功能補氣血，益肝腎，祛風濕，舒筋骨，止痹痛。獨活寄生湯作為中醫的經典方劑，已被廣泛用于膝關節炎、腰痛等骨科疾病的臨床治療中。方中黨參、茯苓、甘草補氣健脾，建運化生之源。正旺則邪自除，當歸、川芎、地黃、白芍養血又兼活血，即所謂治風先活血，血行風自滅牛膝、杜仲、寄生祛風濕、補肝腎、強筋壯骨，獨活祛風、善祛下焦與筋骨間之風寒濕邪，防風祛風邪以勝濕，秦艽除風濕而舒筋，且又風能勝濕，風去濕自除，佐以細辛發散陰經風寒，搜剔筋骨風濕以鎮痛。綜合全方，祛邪扶正，標本兼顧，可使血氣足而風濕除，肝腎強而痹痛愈。本研究中聯合治療組骨愈合效果明顯優于其他3組，說明獨活寄生湯對于骨的生長以及血管生成具有促進的作用[9]。補腎養血法干預后血管數與VEGF水平較DDK1-Ab治療有統計學意義，說明補腎養血法通過改善骨不連模型的缺血狀況來改善局部的營養狀況及促進局部生長因子的聚集，繼而促進骨的愈合[10]。與既往通過促進骨愈合改善骨不連的報道不同，本研究揭示了血管在骨不連的作用以及補腎養血法治療骨折不愈合的潛在機制。

骨不連是骨科臨床上面臨的諸多重要難題之一，目前西醫常采用手術治療，如自體骨移植或干細胞移植等方法，又或通過沖擊波、電刺激局部改善局部微循環[11]。其手術效果一般，主要是無法使纖維、軟骨組織轉變為骨組織。多數骨不連患者都存在受傷時間較長、氣血雙虧、肝腎不足，故而對筋骨、肌肉的生成產生阻礙[12]。局部損傷后血液阻滯血流不暢，久傷引起氣滯血瘀、經絡不通，筋骨長期得不到滋養，最終都會影響骨折的愈合。本實驗通過制備缺血型骨不連模型，配合補腎養血法干預，結果發現補腎養血法可改善骨不連，而潛在機制可能是改善局部的血供[13]。

綜上所述，過表達DKK1可改善骨不連愈合效果。補腎養血法可改善實驗大鼠的骨不連情況，其機制可能與改善局部血液供應相關，但其起主要作用的成分以及治療骨質疏松的其他機制還有待進一步研究。