一株纖維素降解菌的篩選與鑒定

楊 娜，何 鑫，杜春梅

（1黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；3河北環境工程學院/河北省農業生態安全重點實驗室，河北秦皇島 066102）

0 引言

玉米秸稈是一種可再生能源，全國玉米秸稈年產量約2.64億t[1]，其中被有效加工利用的秸稈僅有不到20%。在全球范圍內，玉米秸稈主要通過燃燒的方式處理，造成了極大的浪費而且污染環境。雖然可以用物理和化學方法來有效水解復雜的纖維素聚合物，但物理化學處理通常需要苛刻和極端的條件[2-3]。利用微生物降解秸稈具有效率高、對環境無害且反應溫和的優勢，已經成為秸稈降解研究的熱點，具有廣泛的應用前景。分離和篩選高效纖維素降解菌能為制備高效微生物腐熟劑奠定基礎，利用微生物腐熟劑處理玉米秸稈，對推進生態農業的發展具有重要的科學意義。

纖維素是一種含有β-1,4-糖苷鍵的線性大分子多糖[4-5]，是秸稈細胞壁組成的主要成分，玉米秸稈的纖維素含量高達38%～50%[6]。此外，秸稈中的木質素和半纖維素的存在使得秸稈降解率較低。纖維素可以被纖維素酶完全水解為葡萄糖，首先內切葡聚糖酶沿纖維素鏈隨機水解β-1,4-糖苷鍵，之后外切葡聚糖酶作用于纖維素鏈的還原端或非還原端，對β-1,4-糖苷鍵進行水解產生纖維二糖，最終β-葡聚糖苷酶將纖維二糖和水溶性纖維糊精水解成葡萄糖[7-8]，這3種酶是由細菌、放線菌和真菌等微生物自然產生的[9-10]。微生物可以產生大量的纖維素酶降解秸稈中的纖維素，解決秸稈腐熟速度慢的問題。目前，纖維素降解菌及其產生的酶因其具有經濟潛力大、對生態環境友好而備受關注。前人研究發現產生纖維素酶的微生物主要包括真菌、細菌和放線菌，真菌主要分布在木霉屬、青霉屬、曲霉屬和毛殼菌屬[11-12]，細菌主要分布在芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬[13-15]，放線菌主要分布在鏈霉菌屬[16-17]。然而，盡管已經發現了較多的微生物可用于秸稈腐熟，但是能在生產中應用的并不多，其中很多菌株是從牛糞中分離得到，在糞肥存在的情況下，才能發揮其效力。目前國內氨基酸工業化生產過程中會產生大量的尾液，這些尾液富含大量的蛋白和氨氮類物質，處理難度較大，成本較高[18]，如果能將這些尾液應用于有機肥生產，不但解決了氨氮和秸稈對環境的污染問題，還能產生巨大的經濟效益，有助于推進生態農業的發展。本研究以氨基酸尾液為氮源，對自然堆腐條件不同時期的玉米秸稈進行取樣，篩選高效降解纖維素的菌株并進行鑒定，獲得了能夠快速降解玉米秸稈的菌株，為制備高效玉米秸稈腐熟劑，利用氨基酸尾液和玉米秸稈制備有機肥料奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品采集于自然堆腐發酵各階段，4℃冷藏備用。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基、PDA培養基、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基、種子培養基、玉米秸稈段液體發酵培養基、固體產酶培養基，均參照文獻配制[19-22]。

1.2 菌株的分離純化

取10 g不同時期堆腐中的秸稈，加入到裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，180 r/min搖床培養30 min，靜止20 min，取1 mL進行梯度稀釋，得到濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液，涂布在牛肉膏蛋白胨培養基及PDA培養基上，每個梯度做3個平板，30℃倒置培養，直至菌落長出，挑選不同菌株分離純化，獲得純種菌株。

1.3 菌株的初篩

采用點接種法分別將菌株接種至羧甲基纖維素鈉平板上，每個平板接3個點，30℃培養3天后，用1 mg/mL的剛果紅染液染色30 min，棄去染液，加入1 mol/L的NaCl溶液脫色20 min。降解纖維素的能力以水解圈與菌落直徑比值大小為指標，記錄水解圈和菌落直徑。

1.4 菌株的復篩

1.4.1 纖維素相關酶活性測定 粗酶液的制備：按體積比為15%的接種量將培養物接種于固體產酶培養基中，30℃培養4天，10 g固體產酶培養基加100 mL水，37℃，100 r/min氣浴振蕩提取1 h，發酵液經無菌紗布過濾后在8000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

酶活力測定：濾紙酶活、內切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力、β-葡聚糖苷酶活力，參照許玉林等[23]的方法進行測定。

1.4.2 玉米秸稈降解率測定 將菌株接種至種子培養基，之后按5%的比例接種至玉米秸稈段液體發酵培養基中，以接種等量無菌水為空白對照，在30℃、180 r/min條件下液體發酵10天。液體發酵降解結束后，5000 r/min離心10 min，棄上清，得到的玉米秸稈降解剩余物用無菌蒸餾水反復清洗3次，80℃烘干至恒重，稱重，計算降解率，公式見(1)。

式中，m1為發酵前烘干至恒重的秸稈重量，g；m2為發酵后烘干至恒重的殘余秸稈的重量，g。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態學鑒定 將待鑒定的菌株接種在PDA平板上，28℃恒溫培養5天，觀察菌落形態和顏色，在光學顯微鏡下觀察孢子、產孢體、菌絲的形態結構。參考《真菌鑒定手冊》進行分類鑒定。

1.5.2 分子生物學鑒定 使用真菌基因DNA提取試劑盒（索萊寶）進行DNA提取后，利用曲霉的特異引物[β-tubulin(Ben A)Bt2a 5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3'、Bt2b 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3']擴增，產物由擎科生物測序，將ITS區片段的測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，并采用Mega軟件分析并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與初篩

將從玉米秸稈樣品中分離純化得到的菌株，通過羧甲基纖維素鈉培養基經剛果紅染色后得到6株具有纖維素降解能力的菌株。其中ND19透明圈最大，D/d值為 2.83（表 1）。

表1 剛果紅染色試驗結果

2.2 纖維素降解菌的復篩

2.2.1 纖維素酶活力測定 由圖1可知，不同菌株的同一種酶活力大小不同，相同菌株的4種酶活差別也很大。6株菌中濾紙酶活最大的為SC2，酶活為17.7 U/mL，SC4的內切葡聚糖酶活力最大，為58.97 U/mL，SC4的外切葡聚糖酶活力最大，為16.85 U/mL，但與SC2的差異不顯著，β-葡聚糖苷酶活最高的為SC2，顯著高于其他5株菌，達到79.26 U/mL。

圖1 不同菌株4種纖維素酶的活力

2.2.2 玉米秸稈降解率測定 如圖2所示，6株菌均對玉米秸稈均有一定的降解作用，其中SC2對玉米秸稈的降解效果最好，降解率達到33.07%，SC4的降解效果次之，玉米秸稈的降解率為32.85%。

圖2 不同菌株對玉米秸稈的降解率

2.3 菌株SC2的鑒定結果

2.3.1 形態學鑒定結果 在PDA培養基上，SC2最初為白色，之后變成黑褐色厚絨狀，產生大量黑褐色孢子（圖3A），背面中央略帶黃褐色（圖3B），顯微鏡下觀察，分生孢子梗細長，頂端分生孢子頭呈球形頂囊，上面有大量褐色球形分生孢子，直徑3.2 μm-3.9 μm（圖3C）。

圖3 菌株SC2顯微形態及菌落形態

2.3.2 分子生物學鑒定結果 系統發育進化樹（圖4）顯示，菌株SC2與黑曲霉(Aspergillus niger HQ632726.1)的親緣關系最近，結合其形態特征，將SC2鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。

圖4 菌株SC2的系統發育樹

3 討論

3.1 纖維素降解菌的分離篩選

中國玉米秸稈產量大，如果能夠進行有效的利用，不僅能提高生物質資源的利用，還可以有效降低環境污染。但是秸稈纖維素有很強的糖苷鍵，降解困難，因此大部分纖維素不能被有效利用[24]。目前，大部分玉米等農作物秸稈的處理方式仍然是被焚燒，不但造成資源的浪費，而且污染環境[25]。為了合理有效的利用玉米秸稈纖維素，篩選高效降解纖維素的微生物引起了廣泛的關注。纖維素降解菌通常是從腐殖土壤、腐爛秸稈、牛糞等進行分離。黃亞麗等[26]從土壤中篩選出一株低溫秸稈降解菌長枝木霉，使用沙袋法測定15天、30天、45天的玉米秸稈降解率，結果表明45天時玉米秸稈降解率達到56.73%。劉曉飛等[17]從寒地黑土中分離到一株鏈霉菌，濾紙酶活為11.94 U/mL，培養5天時，對玉米秸稈降解率達到23.54%，其中纖維素降解率為30.33%。Sun等[27]對地衣芽孢桿菌進行了產羧甲基纖維素酶和濾紙酶條件優化，優化后對纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別為35.42%、17.47%和20.19%。張冬雪等[28]在稻田土壤中分離篩選出一株草酸青霉菌，其CMC酶活在第5天時達到最高，為29.35 U/mL，培養15天后對水稻秸稈的降解率達到45.72%。王勇等[29]從堆積枯枝的腐殖土壤中篩選到一株黑曲霉，其濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活分別為17.35、8.47、16.35 U/mL。孫美娜等[30]從棉稈表面分離到4株真菌，分別為黑曲霉、赤霉、鏈格孢霉、青霉菌，10天時黑曲霉對于棉花秸稈的降解率為30.06%。但是，迄今為止未見有從以氨基酸尾液為氮源的自然發酵堆肥中分離秸稈降解菌的報道。本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發酵堆肥中分離到1株黑曲霉SC2，其濾紙酶活為17.70 U/mL，玉米秸稈降解率為33.07%。本研究為提高玉米秸稈的降解率，開發微生物堆肥菌劑或酶制劑奠定了工作基礎。

3.2 利用氨基酸尾液降解秸稈

氨基酸尾液的產量很大，每生產1 t純氨基酸會產生40 t的發酵尾液，培養單細胞酵母蛋白是處理氨基酸尾液最常用的方法，還可以制成復合肥、蛋白飼料等，但成本高、效果也不理想。李思楊[31]以氨基酸尾液為氮源，利用復合菌劑處理水稻秸稈，降解率達到16.08%。這表明可以將氨基酸尾液作為氮源對秸稈進行腐熟，一方面能有效解決氨基酸尾液的治理問題，另一方面氨基酸尾液用于堆肥比尿素成本更低，可以產生更大的經濟效益。本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發酵堆肥中分離到1株降解率較高的菌株，為制備更高效的復合菌劑奠定了基礎。

3.3 復合菌劑降解秸稈的發展趨勢

在自然界中，纖維素的降解過程一般是多種微生物產生的多種酶之間協同作用的結果。而野生型單一菌株很難產生纖維素降解所需要的全部酶，且單一菌株產生的不同酶的活性存在顯著差異，導致其降解作用和效果有限。因此，野生型菌株SC2的降解率還有很大的提升空間，可以通過對其進行發酵條件的優化、高效菌株的選育、以及與其他菌株復配等手段，大大提高其作用效率。Gong等[32]從腐殖質中篩選出3株分別對木質素、纖維素、半纖維素高效降解的菌株，并構建了高效降解玉米秸稈的復合菌系，在最佳工藝條件下，該復合菌系降解后的玉米秸稈失重率達60.55%。李靜等[33]通過分離篩選菌株后將類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬進行復配，對玉米秸稈的降解率為31.8%，比構成復合菌系中的單菌株有顯著提高。后續，本實驗室將利用SC2與其他產纖維素酶菌株組合構建高效的纖維素降解菌系，以期能為高效腐熟玉米秸稈菌劑的研發奠定基礎，為促進玉米秸稈堆肥發酵的腐熟過程，提高玉米秸稈資源的利用提供科學依據。

4 結論

本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發酵堆肥中分離篩選得到1株高效纖維素降解菌SC2，其濾紙酶活為17.70 U/mL，玉米秸稈降解率為33.07%，經過形態學及分子生物學鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。