肺轉移前微環境體外模型的建立與雙參顆粒干預機制

魏華民 俞靜 郭秋均 劉瑞 花寶金

摘要 目的：構建肺轉移前微環境體外模型，觀察S1pr1-stat3信號通路在模型成熟過程中的作用，同時驗證雙參顆粒對該模型的干預作用，探討其可能的機制。方法：體外構建小鼠Lewis肺癌細胞和原代骨髓細胞共培養模型，并用S1pr1激活劑SEW2871干預髓系細胞分化的過程，觀察相關蛋白MMP9、Lox、Version及Fibronectin的表達情況，并檢測模型中骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs）細胞的分化情況及雙參顆粒對模型的干預效果。結果：S1pr1可以明顯促進肺轉移前微環境體外模型的成熟構建，S1pr1-stat3是該模型成熟的關鍵信號通路，雙參顆粒不僅顯著降低模型中該信號通路相關蛋白的表達，同時對微環境成熟的關鍵蛋白的表達也具有抑制作用，還可顯著降低該信號通路相關的骨髓細胞向MDSCs細胞的分化（P<0.05），同時對轉移前微環境中部分腫瘤源性細胞因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）及轉化生長因子（TGF-β）有顯著抑制作用（P<0.05）。結論：雙參顆粒通過抑制S1pr1-stat3信號通路及部分腫瘤源性細胞因子的表達，抑制肺轉移前微環境模型的成熟。

關鍵詞 肺轉移前微環境;雙參顆粒;體外模型;小鼠;S1pr1-stat3信號通路

Establishment of an in Vitro Model of Microenvironment before Lung Metastasis and the Intervention Mechanism of Shuangshen Granule

WEI Huamin1，YU Jing1，GUO Qiujun2，LIU Rui2，HUA Baojin2

（1 Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Guang′an Men Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Abstract Objective：To establish an in vitro model of microenvironment before lung metastasis，and explore the efficacy of S1pr1-stat3 signaling pathway in the mature process and at the same time to verify the intervention effect of Shuangshen Granule （SSG） on the model，and explore its potential mechanism.Methods：Mouse Lewis lung cancer cells and primary bone marrow cells were co cultured in vitro and the differentiation of bone marrow cells were intervened by s1pr1 activator Sew2871.The expression of MMP9，LOX，Version and Fibronectin，and the differentiation of MDSCs cells of the model were observed and the intervention effect of SSG on the model were detected.Results：S1pr1 could significantly promote the construction of the in vitro model of microenvironment before lung metastasis，and S1pr1-stat3 was the key signal pathway for the maturation of the model.SSG not only significantly reduced the expression of the signal pathway related proteins in the model，but also inhibited the expression of key proteins in microenvironment maturation，and significantly reduced the differentiation of bone marrow cells to MDSCs under the effect of signal pathway （P<0.05）.Meanwhile，it also significantly inhibited some tumor-derived cytokines such as GM-CSF and TGF-β in the pre metastasis model （P<0.05）.Conclusion：Shuangshen Granule can inhibit the maturation of the pre-lung metastasis microenvironment model before lung metastasis by inhibiting the expression of s1pr1-stat3 signal pathway and some tumor-derived cytokines.

Keywords Pre-lung metastasis microenvironment; Shuangshen Guanule; In vitro model; Mouse; S1pr1-stat3 signaling pathways

中圖分類號：R273;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.009

肺癌的復發和轉移的預防是肺癌患者治療的重點。近年的研究發現，腫瘤細胞成功轉移前就會通過某些機制在靶器官或組織形成特定的轉移前微環境，以利于腫瘤細胞的種殖和轉移[1-3]。轉移前微環境中的細胞組分如骨髓來源的抑制性細胞（Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs）細胞和一些關鍵蛋白的表達在微環境成熟的過程中起到關鍵作用[4-6]。通過干預轉移前微環境的成熟以抑制腫瘤細胞種殖及轉移成為近年抗腫瘤轉移領域的研究熱點[1-2，7]。本研究通過構建肺轉移前微環境體外模型觀察雙參顆粒的相關干預作用及探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質量（20±2）g，6～8周齡，由中國中醫科學院廣安門醫院動物房負責飼養（飼養溫度控制在18～22 ℃，濕度50%～60%，12 h晝夜節律燈光，自由攝食和飲水）。Lewis細胞購買自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，在中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤實驗中心細胞培養室進行培養（CO2培養箱設定的條件為37 ℃，5%CO2）。

1.1.2 藥物 雙參顆粒組成藥物包括：西洋參、冬蟲夏草、三七（1∶1∶6），3種中藥飲片均由中國中醫科學院廣安門醫院中藥房提供（康美制藥廠，產品批號：三七412041;冬蟲夏草：121281481;西洋參：14110804），干燥后用無菌粉碎機進行粉碎并過100目篩備用，將3種藥物粉末按比例混合后，并按照文獻及衛生質量符合2000版《中華人民共和國藥典》標準對其行紫外線聯合75%乙醇滅菌。SEW2871購自Santa Cruz公司，CAS號為256414-75-2，規格為5 mg。氟尿嘧啶注射液（以下簡稱5-Fu）（上海旭東海普藥業有限公司，批號：H31020593）。

1.1.3 試劑與儀器 Anti-fibronectin antibody（Abcam公司，英國，貨號：Ab2413），Anti-MMP9 antibody（Abcam公司，英國，貨號：Ab38898），Anti-versican antibody（Abcam公司，英國，貨號：Ab19345），Anti-LOX antibody（Abcam公司，英國，貨號：Ab31238），鼠VEGF ELISA試劑盒（Abcam公司，英國，貨號：Ab209882），鼠TGF beta 1 ELISA試劑盒（Abcam公司，英國，貨號：Ab119557），鼠GM-CSF ELISA試劑盒（Abcam公司，英國，貨號：Ab201276）及鼠TNF-alfa ELISA試劑盒（Abcam公司，英國，貨號：Ab100747）。β-actin（ImmunoWay Biotechnology公司，美國，YT0099）.鼠MS CD45 PE MAB 0.1MG 30-F11（Becton，Dickinson and Company，美國，貨號：553081），MS CD11B APC MAB 0.1MG M1/70（Becton，Dickinson and Company，美國，貨號：553312），MS CD16-CD32 PURE MAB 0.1MG 2.4G2（Becton，Dickinson and Company，美國，貨號：553141）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：本實驗體外模型階段按照肺細胞和MDSCs的比例分別為1∶0，1∶0.3，1∶0.6，1∶1，0∶1分為5組，均為正常培養，未與藥物干預。髓系細胞向MDSCs分化過程分為6組分別為正常組，培養24 h組，培養96 h組，Sew2871組，雙參顆粒組，5-Fu組。藥物干預體外模型分為3組即正常組，Sew2871組，雙參顆粒組。

小鼠肺單細胞懸液制備：1）采用頸椎脫臼法處死小鼠。2）在超凈臺中，75%的醫用乙醇消毒小鼠全身皮膚，無菌操作打開胸腔取出肺臟。3）將肺臟移入無菌平皿中，并用無菌PBS清洗肺臟表面血液，去除可見的氣管組織。4）根據需要，取適量肺組織，用無菌眼科剪將其剪碎，用勻漿機勻漿1 min。5）將剪碎的組織加入預熱至37 ℃的新鮮配制的膠原酶V消化液中（175 U/mL），放入37 ℃的恒溫箱中消化1 h，每3～5 min輕輕振搖1次。6）將消化后的肺組織用200目濾網過濾。7）將濾液離心（1 000 r/min，離心半徑8 cm，5 min），去上清，用PBS洗一遍并離心去上清。8）將離心后的細胞加入2 mL紅細胞裂解液，常溫孵育1 min，離心去上清。9）重復第7步2遍。10）加入含1%的胎牛血清的PBS 1 mL得到鼠肺單細胞懸液。

MDSCs細胞制備和分選：1）取正常C57BL/6小鼠頸椎脫位處死后，浸泡于盛有75%乙醇的廣口瓶內15 min。2）沿小鼠下肢根部剪下雙下肢，浸泡于RPMI-1640培養基中，無菌剝離下肢肌肉組織，取出股骨和脛骨，浸泡在RPMI-1640培養基中。3）用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養基沖刷骨髓腔，反復3～5遍，直至骨頭變白。4）收集培養皿中的骨髓細胞懸液于離心管內，1 500 r/min，10 min離心，離心半徑8 cm，棄去上清。5）先用振蕩器稍混勻沉淀細胞，再向其內加入2 mL紅細胞裂解液（室溫）以溶解紅細胞，室溫靜置2 min后加入15 mL RPMI-1640培養基終止反應，1 500 r/min×5 min離心;離心半徑8 cm，棄去上清。6）將得到的髓系細胞在體外加入IL6和GM-CSF（濃度均為10 μg/mL）進行體外培養1周。7）MDSCs分選：按照美天旎Myeloid-derived suppressor cell isolation kit進行MDSCs分選。步驟如下：用MACS專用緩沖液重懸細胞，加anti-Gr-1-biotin，4 ℃放置15～20 min，PBS洗2遍，MACS專用緩沖液重懸細胞，加親和素（Streptavidin）耦聯的免疫磁珠，4 ℃放置15～20 min，然后進行陽性選擇分離，FACS分析，CD11b+Gr-1+MDSC>90%。

共培養技術構建轉移前微環境體外模型構建：在transwell小室中上室加入Lewis細胞3×105個（加入sew2871激活s1pr1受體1 μg/mL），下室加入按比例混勻的肺單細胞懸液和MDSCs的混合物（1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶1、0∶1）使下室細胞總數為3×105個。培養24 h后，對下室內容物進行轉移前微環境標志物檢測。

1.2.2 給藥方法 藥物干預體外模型分為3組即正常組，Sew2871組（給予Sew2871，1 μg/mL），雙參顆粒組（給予雙參顆粒5 mg/mL）。MDSCs分化試驗分為6組即正常組、正常組培養24 h、正常組培養96 h、陽性對照組培養96 h（給予sew2871，1 μg/mL）、雙參顆粒（shuangshen）加SEW2871共培養96 h組、5-Fu加SEW2871共培養96 h組（給予5-氟尿嘧啶0.6 μg/mL）。

1.2.3 檢測指標與方法 首先，我們Western blotting法檢測轉移前微環境模型中Fibronectin、Lox、Version及MMP9的表達水平，以評估模型的成功建立;其次用流式細胞儀檢測S1pr1激活后髓系細胞向MDSC分化的效率及雙參顆粒對該過程的干預效果;然后用Western blotting法檢測共培養模型中S1pr1-stat3信號通路及各標記物的表達;最后用ELISA法檢測細胞培養液中腫瘤生長因子-β（TGF-β）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-GSF）、血管內皮生長因子（VEGF）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行多組之間的數據比較，用ANOVA方法進行方差齊性檢驗，并用SNK法進行兩兩比較，并用Prism 6.0軟件作圖，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺轉移前微環境體外模型的構建 結果發現，當肺細胞和MDSCs細胞比例為1∶1時，各個肺轉移前微環境的成熟蛋白標志物表達最高。見圖1。

2.2 雙參顆粒對肺轉移前微環境體外模型的細胞組分影響 結果發現：正常C57小鼠骨髓組織中MDSCs細胞含量較低，約為0.1%左右（圖2A），當加入刺激劑（IL-6和GM-CSF）后，隨時間延長，MDSCs的分化效率不斷增加（圖2B），但仍效率低下，在96 h時MDSCs的轉化效率也為5%左右（圖2C）。當加入s1pr1激動劑sew2871激活的Lewis共培養后轉化效率明顯增加，4 d轉化效率約43%左右（圖2D），同期無論給予雙參顆粒醇提劑還是5-Fu（陽性對照組），都會明顯降低髓系細胞向MDSCs的分化（圖2G）。

2.3 雙參顆粒對肺轉移前微環境中關鍵信號通路及標志蛋白的影響 實驗結果顯示，雙參顆粒對SEW2871激活的s1pr1及stat3有顯著的抑制作用（P<0.05）。同時也對SEW2871激活的s1pr1帶來的轉移前微環境標志物成熟具有抑制表達的作用（P<0.05）。

2.4 雙參顆粒對肺轉移前微環境中炎癥介質的影響 實驗檢測了共培養模型中12 h、24 h共培養上清液中TDSFs的水平，發現共培養12 h各組TDSFs較對照組無顯著變化（P>0.05）。24 h后TGF-β及GM-CSF在雙參顆粒組有顯著降低（P<0.05），VEGF和TNF-α無顯著變化。5-Fu對各種TDSFs均無顯著抑制作用。

3 討論

本研究發現，雙參顆粒對S1pr1-stat3信號通路激活所誘發的轉移前微環境逐漸成熟及髓系細胞分化導致的轉移前微環境免疫抑制細胞組分具有明顯地抑制作用，這可能是雙參顆粒干預肺轉移前微環境抗肺癌轉移的機制之一。

轉移前微環境是腫瘤細胞遠端轉移的重要基礎[3，8]。一些關鍵蛋白如Fibronecin、Lox、MMP9及Version等逐漸高表達是轉移前微環境逐漸成熟的標志[9-10]。成功的構建肺轉移前微環境是研究其內在機制，制定預防或阻斷肺癌轉移的必要前提。我們前期的實驗已經成功的在荷瘤小鼠體內構建轉移前微環境模型，并發現該藥可以通過干預微環境的成熟起到抗肺癌轉移的作用[11]，為進一步研究雙參顆粒干預轉移前微環境的分子機制，本實驗利用共培養技術構建了體外肺轉移前微環境模型。根據國外學者關于轉移前微環境的研究，發現MDSCs在肺中的比例最高可達到50%左右[12]，所以我們設計了不同比例的配比濃度，發現肺細胞和MDSCs比例為1∶1時，各種轉移前微環境特異性生物標志物表達水平較高，和國外的動物實驗基本一致。轉移前微環境體外模型的建立不僅有利于研究藥物對轉移前微環境的影響，同時對相關信號通路的激活研究也有重要意義。

既往的研究發現，S1PR1-stat3信號通路在肺轉移前微環境的形成中起到了重要作用[10，13-15]。本實驗通過使用S1pr1的激動劑SEW2871，并利用Western blotting技術進行微環境成熟相關的關鍵蛋白驗證，成功的構建了S1pr1-stat3信號通路激活的肺轉移前微環境，這和既往的體內研究結果一致[16]。Deng等[10]的研究發現，S1pr1的激活是stat3蛋白在轉移前微環境中持續表達的關鍵因素，也是微環境逐步成熟的前提。通過干預S1pr1相關信號通路達到抗腫瘤轉移的目的也是國外研究的熱點之一[15]。本研究發現雙參顆粒對S1pr1及其下游stat3的表達有顯著的抑制作用，并通過干預該信號通路對髓系細胞的分化也起到抑制作用，可明顯地減少髓系細胞向MDSCs細胞的分化，而MDSCs細胞被認為是肺轉移前微環境形成過程中的關鍵細胞組分，通過抑制關鍵信號通路從而抑制骨髓細胞的分化可能是雙參顆粒抗肺癌轉移的重要分子基礎。

原位腫瘤通過分泌多種可溶性分子為轉移前微環境的形成制備較適宜的遠端器官局部環境，從而為促進轉移甚至是決定其轉移器官靶向性都起到了關鍵作用。這些可溶性分子包括腫瘤源性分泌因子（TDSFs）、胞外囊泡（EVs）及其他分子。已證實多種TDSFs可通過直接動員和招募骨髓中的髓系細胞來促進轉移前微環境形成，其中包括血管內皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉錄生長因子-β（TGF-β）等，TDSFs還可通過旁分泌的方式激活原位腫瘤微環境中的髓系細胞遷移和功能，促進其在轉移前微環境的種殖，從而成為構建轉移前微環境的關鍵[4，17-19]。本實驗證實，雙參顆粒可以顯著降低肺轉移前微環境模型中部分TDSFs，這不僅從另一個側面證實了雙參顆粒對腫瘤細胞塑造轉移前微環境具有干預作用，同時也為進一步拓展中醫理論，完善中醫處方提供了參考，由于中藥的多靶點的特點，很難對某一特殊位點或因子的釋放達到完全抑制，但可以通過適當配伍以增強其抑制效果，從而帶來更好的療效，如何進一步完善配方是未來研究的重要方向。

關于雙參顆粒的藥效學基礎，既往的實驗發現，該藥組分中的諸多單體對stat3相關的信號通路均有抑制作用，如三七皂苷R1，Panaxadiol，人參皂苷compound K，人參皂苷Rk1都對Stat3蛋白的表達具有一定的調節作用[20-23]。而關于其組分中抑制骨髓細胞分化的相關研究目前尚少，本研究也是首次發現雙參顆粒對骨髓細胞的分化具有一定的調節作用，其具體的有效單體有待于后續研究。

本研究的對于中藥抗腫瘤轉移的研究具有重要參考價值，首先，目前尚缺乏系統的抗腫瘤轉移的相關中醫理論，雙參顆粒是在花寶金教授“扶正調氣”治腫瘤的理論指導下組建的方藥[24]，間接說明益氣活血法對腫瘤轉移具有一定的預防作用，同時借用現代研究成果將中醫治療腫瘤轉移的門檻大大前移了，這是對中醫“治未病”理論的進一步深化。其次，把中藥當成植物藥進行研究，集中觀察中藥對腫瘤細胞本身特性的干預，不僅失去了中醫理論的指導與優勢，而且期待自然藥物演化出勝于化學藥物的消瘤特性顯然也失去了學科特色，本研究從臨床現象歸納出的中醫理論出發，從微觀角度闡釋了益氣活血法對轉移前微環境干預的分子機制，是對花寶金教授“扶正調氣”治腫瘤理論的細化，相信在該理論的指導下進行更多的研究必將豐富和完善中醫抗腫瘤的臨床實踐。

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（2020-11-25收稿 責任編輯：王明）