辣椒尖孢炭疽菌生物學特性研究

沈會芳，楊祁云，謝祥恩，鄧海濱，陳鳳鳳，孫大元，蔣尚伯，林壁潤

（1.廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.南雄市植物保護站,廣東 南雄 512400；3.廣東省煙草南雄科學研究所，廣東 南雄 512400）

【研究意義】廣東省南雄市是重要的北運辣椒生產基地，辣椒種植在農業產業體系中占重要地位。但連年的種植，加之廣東特有的高溫多雨天氣,使辣椒病害特別是炭疽病頻繁發生。炭疽病多發生在辣椒采收前，主要為害果實，嚴重降低辣椒品質和市場價值。一般年份南雄辣椒平均果實發病率達15%～30%，重病地塊可達50%以上，炭疽病成為影響當地辣椒產業的重要因素。開展辣椒炭疽病的生物學特性研究，可為病害防治提供技術支撐。

【前人研究進展】引起辣椒炭疽病的病原菌有20 種以上［1-3］。我國辣椒炭疽病主要由3種病原菌引起，即膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、黑色炭疽菌（C.nigrum）和辣椒炭疽菌（C.capsici）［4-5］。2012 年湖南省芷江縣線果型辣椒品種紅秀2003 果實上發生一種新炭疽病，病原菌鑒定為尖孢炭疽菌（C.acutatum）［6］，后又相繼在四川［7］、江西［8］、山東［9］、陜西［10］、貴州［11］和天津［12］等省市發現尖孢炭疽菌為害辣椒。2020 年對來自廣東南雄的辣椒炭疽病樣本進行病原菌分離，通過致病性測定、形態觀察和ITS 序列分析，最終鑒定為尖孢炭疽菌。近幾年，尖孢炭疽菌的為害逐年加重，農業防治主要以抗性品種為主，Pereira 等［13］鑒定了包含1 年生辣椒（Capsicum annuum）、中國辣椒（C.chinense）、下垂辣椒（C.baccatum）、灌木狀辣椒（C.frutescens）等4 個種在內的129 份辣椒材料對5 株尖孢炭疽菌的抗性。張國芝等［7］對60 份辣椒材料進行了抗病性鑒定，材料中僅有4份抗病，14 份耐病，剩余的均為感病材料，未發現高抗和免疫的材料。盡管抗性育種被認為是控制病害的最有效、經濟、環保的方法，但由于缺少可用的抗病材料，到目前為止世界上育成抗炭疽病的商業化辣椒品種還是極少的［14］。在生物防治方面，朱宏建等［15］分離篩選得到1 株吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus），對尖孢炭疽菌菌絲生長抑制率達71.60%。但生防菌田間施用受環境因素影響較大且防效不穩定，近年來，在辣椒炭疽病上登記使用的生防菌劑僅有1 種。辣椒炭疽病的防治仍以化學防治為主，咪唑類殺菌劑咪鮮胺、三唑類殺菌劑戊唑醇和苯醚甲環唑、甲氧丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯等對辣椒炭疽病有較好的防治效果［16-19］。但因不同地區炭疽病的致病菌種類不同，相同藥劑對不同地區炭疽病田間防效存在較大差異，加大了病害防控難度。

【本研究切入點】廣東南雄辣椒炭疽病的病原菌為尖孢炭疽菌，致病性強，為害重，防治難度較大，自2012 年首次發現尖孢炭疽菌為害辣椒后，研究多集中于病原鑒定和防治藥劑篩選，至今對尖孢炭疽菌的基本生物學特性研究較少，給病害的防治帶來難度。【擬解決的關鍵問題】利用人工接種不同種類辣椒果實研究尖孢炭疽菌的致病性，采用病菌生長速率法和鏡檢孢子量研究溫度、光照、pH、培養基、碳源、氮源等因素對尖孢炭疽菌的影響，明確尖孢炭疽病的生物學特性，以期為病害防控提供理論支持和技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株辣椒尖孢炭疽菌（C.acutatum）分離自廣東省南雄市坪田鎮小塘村辣椒病果，保存于廣東省農業科學院植物保護研究所。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、查氏培養基（Czapek）和燕麥培養基配方見方中達［20］；改良馬丁培養基：蛋白胨5.0 g、酵母浸出粉2.0 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g，pH6.8～7.2；麥芽汁培養基：麥芽膏粉130 g、瓊脂20 g，pH6.8～7.2；辣椒葉煎汁培養基：辣椒葉100 g 切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，加葡萄糖20 g 和瓊脂20 g，pH6.8～7.2；辣椒果實煎汁培養基：辣椒果實200 g 切碎，加水1 000 mL 煮沸30 min，紗布過濾，加葡萄糖20 g 和瓊脂20 g，pH6.8～7.2；PDA +辣椒葉煎汁培養基：PDA 和辣椒葉煎汁培養基等量混合，pH6.8～7.2；PDA +辣椒果實煎汁培養基：PDA 和辣椒果實煎汁培養基等量混合，pH6.8～7.2。上述培養基均于121 ℃高壓滅菌20 min 后備用。

試驗于2019 年6 月至2020 年10 月在廣東省植物保護新技術重點實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 尖孢炭疽菌對不同種類辣椒的致病性 收集朝天椒、線椒、甜椒、螺絲椒、美人椒、黃皮尖椒、綠皮尖椒、皺皮椒、泡椒的辣椒果實，用75%乙醇將辣椒果實擦拭一遍后晾干，每種辣椒設4 個處理：用無菌大頭針在辣椒上密集輕刺5次，取PDA 上培養6 d 的菌絲塊，將菌絲面貼在刺傷處，以無菌瓊脂塊貼在刺傷處為對照；直接將菌絲面貼在健康辣椒果實，以無菌瓊脂塊貼在健康辣椒果實上作對照；用無菌大頭針在辣椒上密集輕刺5 次，將濃度為105個/mL 孢子液滴在刺傷處，以無菌水滴在刺傷處為對照；直接將濃度為105個/mL 孢子液滴在健康果實上，以無菌水滴在健康果實上為對照。每個處理3 次重復，每個重復5 個果實，果實放入磁盤中，26 ℃密封保濕培養，每24 h 觀察辣椒果實發病情況。

1.2.2 溫度對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響將20 mL 的PDA 倒入直徑9 cm 培養皿中，冷卻后制成平板。從PDA 上培養6 d 的菌落外圍切取直徑8 mm 菌絲塊，接入平板中央，設置10、15、20、22、24、26、28、30、32、35 ℃共10個溫度，每個處理3 次重復，每個重復5 個培養皿，放入培養箱中培養8 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑；然后每皿加10 mL 清水，用涂布棒輕輕刮下菌落孢子，混勻后，用血球計數板鏡檢產孢量。

1.2.3 pH 值對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響 在無菌條件下，用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 溶液將PDA 的pH 調至3、4、5、6、7、8、9、10 后，制成平板，接入菌絲塊，每個處理3 次重復，每個重復5 個培養皿，放入26 ℃恒溫培養箱中培養8 d。按1.2.2 測量菌落直徑和產孢量。

1.2.4 光照對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響制備好PDA 平板，接入菌絲塊，設置全光照、全黑暗及12 h光暗交替3個處理，每個處理3次重復，每個重復5 個培養皿，放入26 ℃恒溫培養箱中培養8 d。按1.2.2 測量菌落直徑和產孢量。

1.2.5 不同培養基對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響 將PDA 等9 種培養基倒入直徑9 cm 培養皿中，制成平板，接入菌絲塊，每個處理3 次重復，每個重復5 個培養皿，置于26 ℃恒溫培養箱中培養8 d，觀察菌落形態、菌絲生長情況、菌落致密程度、菌落正反兩面顏色等培養性狀，按1.2.2 測量菌落直徑和產孢量。

1.2.6 不同碳源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響 以Czapek 培養基為基礎培養基，將該培養基中的碳源蔗糖分別用葡萄糖、蔗糖、木糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇和甘油替代，配制成不同碳源的培養基，以不加碳源為對照，在121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min 后，制成平板，接入菌絲塊，每個處理3 次重復，每個重復5 個培養皿，置于26 ℃恒溫培養箱中培養10 d，觀察菌落形態、菌絲生長情況、菌落致密程度、菌落正反面顏色等培養性狀，按1.2.2 測量菌落直徑和產孢量。

1.2.7 氮源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響以Czapek 培養基為基礎培養基，將培養基中的氮源硝酸鈉分別用硫酸銨、尿素、硝酸鈉、天門冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、精氨酸替代，配制成不同氮源的培養基，以不加氮源為對照，在121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min 后，制成平板，接入菌絲塊，每個處理3 次重復，每個重復5 個培養皿，置于26 ℃恒溫培養箱中培養8 d，觀察菌落形態、菌絲生長情況、菌落致密程度、菌落正反面顏色等培養性狀，按1.2.2 測量菌落直徑和產孢量。

試驗數據采用Excell 2007 進行整理和繪圖，用DPS 軟件進行統計，采用鄧肯氏新復極差多重比較法（DMRT）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 尖孢炭疽菌對不同種類辣椒的致病性

將尖孢炭疽菌菌絲塊或孢子液接種在朝天椒、柿椒、線椒、螺絲椒、美人椒、黃皮尖椒、綠皮尖孢、皺皮椒、泡椒果實的針刺傷口上，26 ℃保濕培養3 d，所有種類辣椒均發病，產生水漬狀病斑，繼續保濕培養，病部凹陷，其上可見白色菌絲或大量橘黃色黏孢團，即病菌的分生孢子團（圖1）。采用無傷接種菌絲塊或孢子液4 d 后，僅線椒產生水漬狀病斑和橘黃色黏孢團，其他種類辣椒未發病。在9 類辣椒果實中，朝天椒、美人椒和泡椒為紅果，其余6 種為青果，在傷口條件下，尖孢炭疽菌既可侵染青果，也可侵染紅果。

圖1 尖孢炭疽病菌對不同種類辣椒的致病性Fig.1 Pathogenicity of Colletotrichum acutatum to different kinds of peppers

2.2 溫度對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

溫度對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢量的影響見圖2，病原菌在10～32 ℃范圍內均可生長，適宜菌絲生長溫度在24～28 ℃范圍內，26 ℃時菌落直徑最大，溫度升高到32 ℃時，菌絲生長明顯受抑制，35 ℃時病菌不能生長。在10～30 ℃范圍內，產孢量隨著溫度的上升而增多，30 ℃時產孢量最大，達81.75×106個/皿，溫度升高到32 ℃，產孢量急劇下降。表明辣椒炭疽病菌對低溫耐受，對高溫敏感，溫度高于32 ℃，病菌菌絲生長和產孢量明顯受抑制。

圖2 溫度對辣椒尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Fig.2 Effect of temperature on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

2.3 pH 對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

pH 對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢量的影響見圖3，在pH為3～11范圍內病菌均可生長和產孢，在5～9 范圍內菌絲生長和產孢量較好，且差異不顯著，當pH 低于4 或高于10，菌絲生長和產孢受抑制，菌落直徑和產孢量明顯下降。表明該病菌適應pH 范圍較廣，在偏酸至中性再至偏堿環境中均可正常生長和產孢。

圖3 pH 對辣椒炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Fig.3 Effect of pH on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

2.4 光照對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

不同光照條件對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響見圖4，全光照、12 h 光暗交替和全黑暗處理時，尖孢炭疽菌氣生菌絲均生長旺盛，3 個處理間菌落直徑差異不顯箸。但全光照條件下，產孢量高達84.27×106個/皿，顯著高于12 h 光暗交替和全光照處理的產孢量。表明不同光照條件對尖孢炭疽菌菌絲生長影響不大，但光照利于孢子產生，黑暗明顯抑制產孢。

圖4 光照對辣椒炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Fig.4 Effect of light on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

2.5 不同培養基對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

不同培養基對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響見表1，在供試的9 種培養基中，尖孢炭疽菌均可生長，在PDA 上生長速度最快，培養8 d菌落直徑為61.88 mm，且菌落濃密，其后依次是改良馬丁瓊脂、燕麥瓊脂和PDA+辣椒果煎汁、辣椒果煎汁、PDA+辣椒葉煎汁、麥芽汁瓊脂、查氏瓊脂和辣椒葉煎汁。辣椒果煎汁培養基利于產孢，孢子量達88.33×106個/皿，其次是PDA+辣椒果煎汁和PDA 培養基，病菌在辣椒葉煎汁培養基上的產孢量顯箸小于辣椒果煎汁培養基，在查氏瓊脂和改良馬丁瓊脂的產孢量極差。表明辣椒果煎汁培養基利于菌絲生長和孢子產生，其效果明顯高于辣椒葉煎汁，尤其在促進產孢方面效果明顯。

表1 不同培養基對辣椒炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Table 1 Effect of different medium on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

2.5 不同碳源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

不同碳源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響見表2，在無碳對照培養基上，病菌菌絲可生長，但菌落極稀薄，無孢子產生。可溶性淀粉和蔗糖為碳源時，菌絲生長速度較快，菌落直徑分別達45.17 mm 和44.33 mm，且菌落濃密，其次是葡萄糖和甘露醇。葡萄糖最利于病原菌產生孢子，產孢量為35.03×106個/皿，其次為可溶性淀粉和甘露醇。綜上所述，可溶性淀粉、葡萄糖和甘露醇利于病菌菌絲生長和孢子產生，蔗糖利于菌絲生長但不利于產孢。

表2 不同碳源對辣椒炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Table 2 Effect of different carbon sources on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

2.6 不同氮源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響

供試7 種氮源對尖孢炭疽菌菌絲生長和產孢的影響見表3，在無氮對照培養基上，菌絲可生長，但菌落極稀薄，不產孢。有機氮源牛肉膏和蛋白胨利于尖孢炭疽菌菌絲生長，菌落直徑分別為56.33 mm 和55.80 mm，且菌落致密，濃厚，其次是天門冬酰胺和硝酸鈉，尿素不利于菌絲的生長。牛肉膏作為氮源時，病菌產孢量最大，為43.05×106個/皿，其次為天門冬酰胺和精氨酸。綜上所述，有機氮源牛肉膏利于病原菌菌絲生長和產孢。

表3 不同氮源對辣椒炭疽菌菌絲生長和產孢的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelium growth and spore production of Colletotrichum acutatum from pepper

3 討論

2019 年4 月至2020 年6 月在廣東南雄調查時發現，辣椒炭疽病發生普遍，對當地特色黃辣椒造成嚴重危害，分離純化其病原菌，經致病性測定、形態特征觀察和ITS 序列分析，鑒定病菌為尖孢炭疽菌（C.acutatum）。尖孢炭疽菌寄主范圍極廣，除侵染辣椒外，也可侵染蘋果、鱷梨、枇杷、橡膠、芒果、銀杏、草莓、冠狀銀蓮花、茄子、山茶屬、蠶豆屬和白酒草屬植物［6］。尖孢炭疽菌致病力較強，既可侵染未成熟青果，也可感染成熟紅果，而膠孢炭疽病菌（C.gloeosporioides）不感染青果，可感染紅果［21］。本研究證實了南雄辣椒尖孢炭疽病菌可侵染青果和紅果，同時發現病菌在有傷口時可侵染指天椒、柿椒、線椒、螺絲椒、美人椒、黃皮尖椒、綠皮尖孢、皺皮椒、泡椒9 種類型辣椒果實，在無傷條件下只侵染線椒。霍建飛等［12］、高楊楊等［9］也報道在無傷口情況下，尖孢炭疽菌能夠侵染健康的辣椒果實，使其患病。廣東南雄特色黃辣椒正是線椒品種，對尖孢炭疽菌敏感，在適宜條件下，病菌孢子可以通過雨水濺射、灌溉水漫灌等方式傳播到健康植株，造成連片危害，這可能是南雄辣椒炭疽病發生嚴重的重要原因之一。

膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）在 10～35℃范圍內均能生長，適宜溫度為25～30 ℃，最適溫度為25 ℃，低于10 ℃和高于35 ℃時生長受抑制，30 ℃時產孢量最大，pH 值6～9 范圍內菌絲生長較好［22-24］。辣椒炭疽菌（C.capsici）在12～36 ℃均能生長，20～32 ℃均能產孢，生長和產孢的最適溫度均為26～28 ℃，最適pH 為4.5～6.5，黑暗利于菌絲生長和產孢［25］。對于尖孢炭疽菌（C.acutatum），楊佳文報道，溫度25 ℃、連續光照、pH 為6時利于菌絲生長；溫度30 ℃、連續光照、pH 為5～6 利于產孢［10］。本研究發現尖孢炭疽菌最適菌絲生長溫度在24～28 ℃范圍內，26 ℃時菌絲生長最快，32 ℃時生長受抑制，30 ℃時產孢量最大，pH 值在5～9 范圍內菌絲生長和產孢量較好，菌絲生長不受光照條件的影響，但光照促進病菌產孢。可見尖孢炭疽菌適宜生長溫度低于膠孢炭疽菌，與辣椒炭疽菌相似；膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌適宜pH 值更寬，在偏酸至中性至偏堿均可正常生長，辣椒炭疽菌喜好偏酸性。以上結果表明不同辣椒炭疽菌的生物特性存在種間差異。廣東南雄地處廣東北部，5—6 月是辣椒結果收獲期，5 月份氣溫在21～29 ℃，6 月份氣溫在23～32 ℃，適宜病害的發生發展，加上病菌適宜生長pH 值較寬，在偏酸、中性及偏堿土壤中均可正常生長產孢，可見南雄當地環境因素利于辣椒炭疽菌的生長和增殖。

本研究顯示辣椒果煎汁培養基利于菌絲生長和孢子產生，其效果明顯高于辣椒葉煎汁，尤其在促進產孢方面效果明顯。唐景美報道辣椒煎汁和辣椒煎汁+蔗糖可促進附著胞形成，附著胞在辣椒煎汁中形成率最高［22］。辣椒炭疽菌（C.capsici）菌絲生長和產孢的最適碳源分別為麥芽糖和淀粉，膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）菌絲生長的最適碳源為果糖和葡萄糖，產孢的最適碳源為山梨糖。2 種辣椒炭疽菌菌絲生長的最適氮源為牛肉膏和蛋白胨，產孢的最適氮源為酵母［24］。楊佳文報道碳源葡萄糖、氮源酵母浸膏適合尖孢炭疽菌菌絲生長，碳源麥芽糖、氮源酵母浸膏適合產孢［10］。本研究結果顯示可溶性淀粉、葡萄糖和甘露醇利于病菌生長和孢子產生，有機氮源牛肉膏利于病原菌菌絲生長和產孢。表明不同地區的尖孢炭疽菌菌株對碳、氮源的利用存在區域差異性。

4 結論

尖孢炭疽病在廣東南雄辣椒種植區發生普遍，較難防治，給當地種植戶造成較大損失。本研究發現尖孢炭疽病菌致病性強，在傷口條件下，可侵染青果和紅果，無傷條件下侵染線椒品種；適宜尖孢炭疽菌菌絲生長溫度在24～28 ℃范圍內，26 ℃時菌絲生長最快，30 ℃時產孢量最大，pH值在5～9 范圍內菌絲生長和產孢量較好，光照促進病菌產孢；辣椒果煎汁培養基促進產孢方面效果明顯，炭源可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇和有機氮源牛肉膏利于病菌菌絲生長和產孢。研究結果表明：尖孢炭疽菌的生物學特性與辣椒炭疽菌的重要種類膠孢炭疽菌和辣椒炭疽菌存在明顯種間差異，病害防治時需明確當地炭疽病菌種類，有針對性的制定防治策略，提高防治效果，特別是線椒種植區，需要提前預防，防止病害爆發。