中耳黏膜的掃描電鏡樣品制備方法的改進

首都醫科大學中心實驗室（100069）姬曼 趙君朋

掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）具有分辨率高、視野大、景深長和立體感強等優勢，SEM既可以在低放大倍數下觀察樣品整體的三維結構，也可以通過高倍放大研究樣品表面超微形貌特點，因此SEM是研究組織細胞表面微細結構研究的一種必不可少的工具[1]。中耳（聽泡）解剖位置深邃，位于顳骨巖部，中耳黏膜上皮起源于內胚層，附于周圍骨或軟骨組織表面，腔內的立體結構錯綜復雜[2][3]。由于黏膜層薄而骨組織較厚且細胞的含水量不同，樣品制備過程中組織收縮性不同，骨組織脫水變脆，極易發生形變損毀，從而導致附著黏膜層斷裂和細胞表面的變形失真[3]。因此，對中耳黏膜組織進行大視野、立體結構觀察時，保持組織完整性是困擾SEM工作者的棘手問題。本研究嘗試在樣品制備環節引入脫鈣處理，取得了比較理想的效果，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本取材 3只健康SD大鼠（體重250～300g），稱重后腹腔內注射6%水合氯醛（30mg/kg）麻醉，經鼓膜注入2.5%戊二醛1～2ml后斷頭處死動物，取出聽泡。

1.2 掃描電鏡標本的制備 分別用兩種方法處理組織塊：①正常對照組：樣品用緩沖液沖洗黏液和血跡后，2.5%戊二醛固定6h，在解剖鏡下分離得到咽鼓管和鼓室部位組織，入1%四氧化鋨固定1h，然后依次經50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水，每次5min；最后放入臨界點干燥儀中，處理1.5h；干燥后的樣品粘于樣品臺上，經離子濺射儀鍍膜，于掃描電子顯微鏡下觀察并記錄。②脫鈣處理組：樣品用緩沖液沖洗黏液和血跡后，首先2.5%戊二醛固定6h，在解剖鏡下分離得到咽鼓管和鼓室部位組織，置10%EDTA溶液中（4℃）脫鈣處理12h，后續處理同對照組。

2 結果

掃描電鏡下觀察顯示：中耳黏膜中主要有纖毛細胞、無纖毛細胞、杯狀細胞及扁平細胞組成。纖毛細胞表面分布豐富的纖毛；無纖毛細胞表面具有短的微絨毛；杯狀細胞表面附有分泌黏液滴。扁平細胞呈現多角形，表面分布有短微絨毛。在中耳腔的不同部位，各種細胞的比例有顯著不同。纖毛細胞主要分布在咽鼓管下壁，而鼓呷部和后鼓室相對較少。鼓室口下壁分布叢狀纖毛細胞，纖毛上皮間可見無纖毛細胞，無纖毛細胞表面可見大量微絨毛，但幾乎看不到扁平細胞（附圖1）。咽鼓管峽部，纖毛分布致密，纖毛密而長，形成纖毛毯，纖毛細胞間有一些分泌黏液的杯狀細胞分布。扁平細胞多為六邊形，表面平坦有微絨毛，細胞邊界清晰，呈鑲嵌排列（附圖2），多分布于后鼓室、鼓岬后部及鼓膜松弛部。此外，鏡下可見常規處理樣品，黏膜表面可見明顯龜裂紋（附圖1B，附圖2B）；EDTA脫鈣處理組樣品，隨著脫鈣時間的延長，黏膜表面龜裂紋明顯減少，黏膜中纖毛細胞、無纖毛細胞表面形貌特征與對照組無明顯差異（附圖1A，附圖2A）。

附圖1 中耳咽鼓管鼓室口處黏膜掃描電鏡觀察。A脫鈣處理組；B正常對照組。bar=10um

附圖2 乳突氣房黏膜掃描電鏡觀察。A脫鈣處理組；B正常對照組。bar=10um

3 討論

中耳黏膜結構復雜精巧，且深埋于顳骨巖部，聽泡周圍骨質精細脆弱，在制備過程中極易損毀變形，因此中耳黏膜掃描電鏡樣品制備不易成功[2][3]。本研究借鑒骨組織切片中脫鈣處理原理，利用脫鈣液使骨組織充分脫鈣，以保證樣品結構的完整性。骨組織一種堅硬且有韌性的結締組織，它由鈣化的細胞外基質即骨基質和骨細胞構成。傳統的骨組織脫鈣處理采用強酸溶液脫鈣，雖然脫鈣速度快，但造成組織細胞腫脹或碎裂等問題，影響觀察結果的準確性和真實性[4][5]。以乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）為代表的螯合劑類脫鈣液可以通過與骨組織中鈣離子的結合達到脫鈣目的，雖對細胞結構及抗原免疫活性影響最小，但其脫鈣時間明顯長于酸類脫鈣液[4][5]。

本研究首先用2.5%戊二醛前固定，再入EDTA脫鈣液中脫鈣處理。固定是整個組織處理過程的關鍵，電鏡樣品制備一般多用戊二醛固定。戊二醛一方面可對組織完全徹底的固定，可以使樣品在脫鈣過程中組織結構免受破壞。另一方面，有研究表明戊二醛可以加大脫鈣液的穿透力而加快脫鈣速度[5]。所以，在前固定后立即進行EDTA脫鈣處理，既有保護組織的結構又能縮短脫鈣時間，從而使樣品制備既快又好，節約時間和成本。掃描電鏡下觀察，EDTA脫鈣處理后黏膜細胞超微形貌特征無變化，且樣品碎裂現象有明顯改善。此方法也對其他骨性組織樣品制備均有一定的借鑒意義。