飼糧中添加β-羥基-β-甲基丁酸對巴馬香豬生長性能和肝臟脂肪代謝的影響

鄭昌炳 宋 博 鄭 界 仲銀召 張仕宇 段葉輝* 印遇龍**

(1.華南農業大學動物科技學院，廣州510642；2.中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，動物營養生理與 代謝過程湖南省重點實驗室，中國科學院亞熱帶農業生態研究所，長沙410125)

巴馬香豬是原產于廣西巴馬瑤族自治縣的脂肪型豬種，有肉質鮮美、性成熟早、抗逆性強等特點，但生長速度緩慢、瘦肉率低，加之傳統放養模式，養殖效率低[1]。通過營養調控提高巴馬香豬的養殖效率，對生產優質豬肉、提高經濟效益有重要意義。β-羥基-β-甲基丁酸(beta-hydroxy-beta-methylbutyrate，HMB)是必需氨基酸亮氨酸的代謝產物，有促進肌肉生長、減少脂肪沉積的作用，但在體內代謝產生的量較少，需通過飼糧補充才能發揮作用[2-4]。研究表明，飼糧添加0.62% HMB可顯著降低長大二元雜交生長豬的總脂肪重，改善其脂肪代謝，其作用可能由腺苷酸活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)信號通路所介導[5]。然而，HMB在巴馬香豬上的應用效果目前鮮見報道，我們推測飼糧中添加適量HMB可調節巴馬香豬生長性能和脂肪代謝。本試驗通過在巴馬香豬飼糧中添加不同水平的HMB，研究其對巴馬香豬生長性能和肝臟脂肪代謝的影響，并篩選出HMB的最適添加量，為HMB在巴馬香豬上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選擇32頭健康、體重[(8.58±0.21) kg]相近的純種巴馬香豬[閹公豬，(60±2)日齡]，隨機分為4組(每組8頭豬，分別飼喂添加0(對照組)、0.13%、0.64%、1.28% HMB[實際添加物為β-羥基-β-甲基丁酸鈣(beta-hydroxy-beta-methylbutyrate calcium,HMB-Ca]的飼糧。所有飼糧均參照我國《豬飼養標準》(NY/T 65—2004)配制而成，飼糧組成及營養水平見表1。飼養試驗于2019年9月8日至2019年11月7日在中國科學院亞熱帶農業生態研究所動物試驗基地開展。試驗期間，試驗豬在漏糞地板式豬床上單欄飼養，自由采食，自由飲水，每日飼喂次(08：00、12:00、18:00)。消毒及免疫程序按照常規程序進行。試驗期60 d。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 樣品采集

試驗結束時，將所有巴馬香豬禁食12 h，自由飲水，然后前腔靜脈采血后屠宰取樣，血液樣品靜置1 h后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min分離血清，將血清收集于1.5 mL EP管后-20 ℃保存以供后續檢測。采集肝臟樣品，用于肝臟脂肪酸組成和脂肪代謝相關基因表達的測定。

1.3 指標測定及其方法

1.3.1 生長性能

試驗豬分別于試驗開始和結束當天08:00—09:00空腹稱重，試驗期間記錄采食量，用于計算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F/G)。

1.3.2 血清脂肪代謝相關生化指標

使用全自動血清生化儀(Beckman CX4)檢測血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的含量。

1.3.3 肝臟脂肪酸組成

稱取肝臟凍干樣品0.3 g左右，經過苯-石油醚(1∶1，體積比)提取后，經氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化30 min，加水分層，取500 mL上層液通過外標-氣相色譜-質譜法檢測肝臟組織中長鏈脂肪酸含量，具體操作參照Hu等[6]所述方法進行。各類脂肪酸含量表示為占總脂肪酸的百分比；基于脂肪酸組成計算：多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)/飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)比值、n-6/n-3 PUFA比值。

1.3.4 肝臟脂肪代謝相關基因mRNA表達量

采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)從肝臟組織中提取總RNA，經紫外可見光光度計(NanoDrop ND-1000,Thermo Fisher,美國)檢測RNA質量和濃度。取1 000 ng總RNA按照TaKaRa逆轉錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)說明書進行逆轉錄合成cDNA。采用實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)檢測肝臟中脂肪代謝相關基因的mRNA表達量，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，檢測乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、激素敏感脂酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)、脂肪酸轉運蛋白-1(fatty acid transport protein-1，FATP-1)、脂肪酸移位酶(fatty acid translocase，FAT/CD36)、過氧化物酶增殖體激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶-1B(carnitine palmitoyl transferase-1B，CPT-1B)、增強子連接蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)、固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)的mRNA表達量，引物序列見表2。具體測定參照Duan等[3]的方法進行。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.4 統計分析

試驗數據用Excel 2010進行初步處理，用SAS 8.2軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較檢驗，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 飼糧中添加HMB對巴馬香豬生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了巴馬香豬的末重和ADG(P<0.05)；但飼糧中添加HMB對巴馬香豬的ADFI和F/G無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加HMB對巴馬香豬生長性能的影響

2.2 飼糧中添加HMB對巴馬香豬血清脂肪代謝相關生化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了血清中HDL含量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著增加了血清中CHOL含量(P<0.05)，顯著減少了血清中HDL含量(P<0.05)。此外，血清中LDL含量有隨HMB添加量增加而提高的趨勢(P=0.08)，但飼糧中添加HMB對血清中TG含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧中添加HMB對巴馬香豬血清脂肪代謝相關生化指標的影響

2.3 飼糧中添加HMB對巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著增加了肝臟中n-3 PUFA(33.33%)、二十二烷酸(C22∶0，42.31%)、二十二碳六烯酸(C22∶6n-3，33.33%)含量(P<0.05)，顯著降低了n-6/n-3 PUFA比值(28.31%)和二十碳烯酸(C20∶1，20.00%)、花生四烯酸(C20∶4n-6，12.99%)含量(P<0.05)；飼糧中添加0.64%HMB顯著增加了肝臟中二十碳烯酸(C20∶1，22.85%)、二十二烷酸(C22∶0，26.92%)、二十碳三烯酸(C20∶3n-6，50%)含量(P<0.05)，顯著降低了花生四烯酸(C20∶4n-6，14.76%)含量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著增加了二十二烷酸(C22∶0，38.46%)和二十碳三烯酸(C20∶3n-6，67.64%)含量(P<0.05)，顯著降低了十七烷酸(C17∶0，31.88%)和花生四烯酸(C20∶4n-6，12.99%)含量(P<0.05)。

表5 飼糧中添加HMB對巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響(占總脂肪酸的百分比)

2.4 飼糧中添加HMB對巴馬香豬肝臟脂肪代謝相關基因mRNA表達量的影響

如圖1所示，與對照組相比，飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了肝臟中FAT/CD36和PPARα的mRNA表達量(P<0.05)；飼糧中添加0.64%HMB顯著降低了肝臟中HSL的mRNA表達量(P<0.05)；飼糧中添加1.28%HMB顯著降低了肝臟中HSL和FATP1的mRNA表達量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加HMB對巴馬香豬生長性能的影響

添加劑應用的前提條件是確保其安全性，大量研究表明HMB的使用是安全的，并且具有改善機體健康狀況的潛力。據報道，動物連續16周攝入8～5 000 mg/(kg·d) HMB未見不良影響[7-8]。本試驗結果顯示，給巴馬香豬分別飼喂含有0.13%、0.64%和1.28% HMB的飼糧60 d，對生長性能無任何負面影響，且適宜添加量的HMB(0.13%)還可改善生長性能，與上述試驗結果一致。

3.2 飼糧中添加HMB對巴馬香豬血清脂肪代謝相關生化指標的影響

血清TG、CHOL、HDL和LDL含量是反映機體血脂肪代謝的常用指標。HDL和LDL是CHOL的運輸載體，HDL可將CHOL運輸至肝臟使其代謝生成其他物質，具有清除血漿多余CHOL的作用，LDL則負責將肝臟中CHOL運輸至肝外組織，被認為是心血管疾病的制動劑，兩者共同維持機體CHOL的穩態[9-10]。血清中高含量的TG和CHOL是心血管疾病的重要風險因素[11-12]。前期研究表明，HMB(1%，質量體積分數)可改善高脂誘導肥胖小鼠的血脂代謝，降低血清中TG和CHOL含量[13]。在長大二元雜豬上的研究顯示，飼糧中添加0.62%HMB顯著降低了二元雜豬血清LDL含量[14]。本試驗結果顯示，在飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了巴馬香豬血清中HDL含量，表明飼糧中添加適量HMB后改善了巴馬香豬的血脂代謝。此外，本試驗結果還顯示飼糧中添加1.28%HMB降低了巴馬香豬血清中HDL含量，升高了CHOL含量，推測飼糧中添加高水平的HMB可通過在體內代謝生成羥甲基戊二酸單酰輔酶A(合成CHOL的前體物質)而增加血清中CHOL含量[15-16]。這與我們前期的試驗結果[13]一致，前期試驗結果顯示高水平HMB處理對高脂誘導肥胖小鼠脂肪代謝并無改善效果。綜上可知，飼糧中添加HMB可改善巴馬香豬的血脂代謝，其適宜添加量為0.13%，添加高水平HMB并未取得疊加的改善效果；此外，可能存在低于0.13%HMB的更適宜添加量，還需進一步的試驗研究。

數據柱無字母或標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.3 飼糧中添加HMB對巴馬香豬肝臟脂肪酸組成的影響

脂肪酸可分為SFA、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)和PUFA，根據首個雙鍵距離分子末端甲基位置的不同又可將PUFA分為n-3和n-6 PUFA[17]。n-3 PUFA具有調節機體血脂、抗炎等生理功能，而n-6 PUFA的生理功能則與之相反，具有促炎作用。n-6/n-3 PUFA比值低的膳食被認為可預防心血管疾病、癌癥等疾病[18]。因此，通過飼糧途徑增加豬肉產品中n-3 PUFA含量并降低n-6 PUFA含量被認為是改善豬肉品質的一種有效有段[19]。值得注意的是，機體n-3 PUFA含量并非越高越好，過量的n-3 PUFA會導致豬肉過氧化、生物膜受到損傷等問題。因此，提高豬肉產品中n-3 PUFA含量的同時平衡其n-6/n-3 PUFA比值，對生產出符合人類健康需求的肉制品就顯得非常重要[18]。本試驗結果表明，飼糧中添加0.13%HMB顯著提高了肝臟中C22∶6n-3含量，并降低了花生四烯酸含量和n-6/n-3 PUFA比值，這可能是由于飼糧中添加0.13% HMB促進了巴馬香豬對營養物質吸收并促進了肝臟從血液中攝取n-3 PUFA。C22∶6n-3是一種n-3 PUFA，可提高血清中HDL含量，降低LDL、TG和CHOL含量，從而降低血液黏度，改善血液循環，發揮降脂、抗炎和預防心血管疾病等作用[19-20]。我們推測，飼糧中添加HMB可通過提高巴馬香豬肝臟中C22∶3n-3的含量來增加血清中HDL的含量，從而減少機體CHOL的含量，進而改善機體脂肪代謝。此外，在禁食情況下，機體會動員肌肉和脂肪組織中的TG，運輸至肝臟分解為脂肪酸為機體供能[21]，因此，肝臟中脂肪酸的組成情況可在一定程度上反映豬肉中脂肪酸的組成情況。綜上可知，飼糧中添加HMB可通過提高n-3 PUFA含量和降低n-6/n-3 PUFA比值來改善豬肉品質，且其添加量為0.13%時效果最佳。此外，可能存在低于0.13%HMB的更適宜添加量，還需進一步的試驗研究。

3.4 飼糧中添加HMB對巴馬香豬肝臟脂肪代謝相關基因mRNA表達量的影響

肝臟是豬脂肪代謝的主要場所之一，ACC、HSL、FAT/CD36、FATP1、PPARα等是參與脂肪代謝的關鍵酶。其中，ACC和HSL分別是脂肪酸合成與分解的關鍵限速酶[22-23]；FAT/CD36是將脂肪酸轉運至胞內的轉運載體[24]，其表達量升高暗示肝臟從血液中攝取的脂肪酸增多；FATP1是一種對胰島素敏感的長鏈脂肪酸轉運載體[25]，其表達量降低說明轉運入肝臟中的脂肪酸減少；轉錄因子PPARα是肝臟脂質代謝的主要調節因子，其激活可促進肝臟脂肪酸的攝取、利用和分解代謝[26]，亦可促進HDL和C22∶6n-3的生成[27-28]。本試驗結果顯示，飼糧中添加0.13%HMB可增加巴馬香豬肝臟中FAT/CD36和PPARα的mRNA表達量，而添加1.28%HMB則能降低肝臟中HSL和FATP1的mRNA表達量。因此，本試驗結果表明，飼糧中添加0.13%HMB可促進肝臟從血液中攝取脂肪酸，通過PPARα促進C22∶6n-3的生成，進而提高血液中HDL含量，改善機體脂肪代謝，而添加1.28%HMB則促進了肝臟脂肪酸合成并抑制了脂肪酸分解。

4 結 論

① 在巴馬香豬飼糧中添加HMB可改善其生長性能，并可提高肝臟中C22∶6n-3含量，改善肝臟脂肪代謝，其適宜添加量為0.13%。

② HMB改善巴馬香豬肝臟脂肪代謝的機制可能與PPARα信號通路相關。