不同類型酒糟瘤胃發酵特性和甲烷產量的比較

代秦丹 王之盛 胡 瑞 周芯宇 祝伊梟 汪 成 王雪瑩 鄒華圍 師俊華 彭全輝 薛 白 王立志

(四川農業大學動物營養研究所，四川省牛低碳養殖與安全生產高校重點實驗室，成都611130)

酒糟是釀酒加工的副產物，產量巨大，2019年我國僅白酒糟的產量就達2 115萬t[1]。釀酒是一個多菌協同作用的過程，此過程中大量營養成分被轉化利用。與常規飼料不同，經釀酒過程后，雖然酒糟中仍含有相當多的未利用的蛋白質、淀粉等營養成分，但難以降解的致密纖維結構比例也相應增加[2]。導致酒糟在單胃動物中的利用受到限制，而在反芻動物飼糧中，酒糟可作為一種優質低成本飼料資源。飼糧中添加一定比例的酒糟能改善肉牛的生長性能，節約飼料成本[3]。我國酒種類眾多，不同種類酒的釀造原料及釀造工藝相差較大，導致酒糟難溶性碳水化合物以及微生物代謝產物種類和比例也有區別。研究發現相同類型酒糟營養組成差異較小，而不同類型酒糟營養組成差異較大[4-5]，但反芻動物瘤胃對不同類型酒糟的利用效果還尚不明確。

利用體內法評定飼料的發酵特性和甲烷(CH4)產量需要大量飼料原料，費時費力，成本高，且一般不適用于單一飼料。與之相比，體外法成本相對較低，發酵結果與體內法有高度相關性[6]，目前廣泛應用于飼料資源的評估。反芻動物瘤胃微生物可利用飼糧中碳水化合物生成氨態氮(NH3-N)、揮發性脂肪酸(VFA)和微生物蛋白(MCP)，同時還伴隨著CH4及二氧化碳(CO2)等氣體產生。CH4是重要的溫室氣體，據估計，全球反芻動物瘤胃發酵產生的CH4排放量占人類活動產生的20%～25%[7]，而反芻動物自身以甲烷能形式損失的能量占飼料總能的5%～12%[8]。但不同類型酒糟的CH4排放情況還鮮有報道，目前大多研究是針對某一類型酒糟，如孟杰等[9]體外試驗發現白酒糟的CH4產量低于玉米秸稈和大豆秸稈，而對不同類型酒糟瘤胃發酵特性以及CH4產量還有待研究。因此，本試驗利用體外產氣技術探索不同類型酒糟在瘤胃中的瘤胃發酵特性和CH4產量，并在此基礎上分析不同酒糟營養成分與CH4產量和VFA濃度的相關性，為我國肉牛養殖生產實踐中科學使用酒糟飼料提供試驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采集醬香型發酵酒糟(MFDG)、醬香型酒糟(MDG)、濃香型酒糟(LDG)、青稞糟(HBG)、玉米酒精糟(DDGS)、啤酒糟(BDG)6種酒糟各500 g，于65 ℃條件下烘干，一部分粉碎過40目篩用于營養成分測定，一部分過18目篩用于體外發酵試驗。

1.2 試驗處理

利用體外產氣技術，評定濃香型酒糟、醬香型酒糟、青稞糟、醬香型發酵酒糟、玉米酒精糟和啤酒糟在體外發酵24、48和72 h后瘤胃發酵特性和CH4產量的差異，每種酒糟在發酵24、48和72 h時間點各設5個重復，并記錄2、4、6、9、12、24、36、48、72 h時發酵管刻度讀數。

1.3 瘤胃液采集

瘤胃液于晨飼前2 h，以口腔插管的方法取自2歲健康的3頭荷斯坦奶公牛[體重(627.83±20.05) kg]，瘤胃液經4層無菌紗布過濾到充滿CO2的保溫瓶中，并迅速送回實驗室。奶公牛飼養于四川農業大學動物營養所試驗基地。

1.4 體外發酵試驗

參照Menke等[10]方法配制人工唾液，進行體外發酵。稱取300 mg發酵底物于100 mL密封性良好的透明玻璃發酵管底部，試驗另設3個未添加任何底物的空白對照，用于矯正累積產氣量(GP)。管塞下部2/3處均勻涂抹凡士林，塞進外管30 mL刻度線處，注射口連接約6 cm的橡膠管。采集的瘤胃液與人工唾液按1∶2混合為發酵液，每個發酵管注入30 mL發酵液，排出管內多余空氣，夾好夾子，即記錄初始刻度。在(39.0±0.5) ℃恒溫振蕩水浴鍋中分別進行24、48和72 h體外發酵試驗。各時間段發酵結束后，記錄發酵管刻度，然后用鋁箔集氣袋收集氣體，待測CH4、氫氣(H2)和CO2含量。最后將發酵管置于冰水中終止發酵，發酵液分裝于10 mL無菌離心管中，72 h發酵結束后測發酵液pH，其余-20 ℃保存，用于NH3-N、VFA濃度和MCP含量的測定。

1.5 指標測定與分析

1.5.1 酒糟營養成分測定

干物質(DM)、粗灰分(Ash)和粗蛋白質(CP)含量分別按照GB/T 6435—1986、GB/T 6438—2007和GB/T 6432—1994測定；參照Van Soest等[11]方法測定樣品中的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量；中性洗滌可溶物(NDS)=100-NDF；總能(GE)使用氧彈式熱量計(PARR-1281型)測定。

1.5.2 GP和產氣動力學參數的計算

GP的計算公式[12]如下：

GPt=200×(Vt-V0)/W。

式中：GPt為t時間點的累積產氣量(mL/mg)；Vt為樣品發酵t小時后培養管刻度讀數；V0為樣品在開始培養時空白培養管刻度讀數；W為樣品干物質重量(mg)。

參照指數模型對不同酒糟的GP進行非線性回歸擬合[13]:

GPt=B×[1-e-c×(t-lag)]。

式中：GPt為t時間點的累積產氣量(mL/mg)；B為理論最大產氣量(mL/mg)；c為產氣速度(%/h)；t為培養時間(h)；lag為產氣延滯時間(h)。

1.5.3 瘤胃發酵參數測定

參照Khorasani等[14]方法對發酵液進行處理，使用氣相色譜儀(CP-3800)測定乙酸、丙酸和丁酸濃度，總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度為乙酸、丙酸和丁酸濃度之和。發酵液pH采用雷磁25型pH酸度計測定。參照Broderick等[15]的比色法測定NH3-N濃度。參照王曉光[16]的差速離心法提取MCP沉淀，稀釋后使用南京建成生物工程研究所BCA蛋白定量測試盒測定MCP含量。

1.5.4 氣體成分含量測定

采用氣相色譜儀(福立GC9790Ⅱ)測定氣體中CH4、H2和CO2的百分含量。測定條件為載氣：氬氣，氣體流量：20 mL/min，進樣量：0.5 mL；TCD檢測器，柱子型號：TDX-01(1 m×1/8)，柱箱：80 ℃，檢測器溫度：120 ℃，進樣口溫度：120 ℃。

氣體產量=GPt×百分含量。

式中：氣體產量為單位發酵底物的CH4、CO2或H2產量(mL/mg)；GPt為樣品在t時刻的累積產氣量(mL/mg)；百分含量是發酵產生的總氣體中CH4、CO2或H2百分比例測定值。

1.6 數據統計與分析

試驗數據經Excel 2018整理后，用SPSS 20.0統計軟件進行one-way ANOVA并以Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。對發酵特性和營養成分之間進行Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同酒糟的營養成分

由表1可知，不同類型酒糟CP含量為15.20%～30.71%。玉米酒精糟CP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，濃香型酒糟CP含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)。濃香型酒糟NDF、ADF以及Ash含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。玉米酒精糟NDF和ADF含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)，而NDS含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。啤酒糟GE顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表1 不同酒糟的營養成分(干物質基礎)

2.2 不同酒糟的GP及產氣動力學參數

由圖1可知，隨著發酵時間推移，不同類型酒糟GP都呈增加的趨勢，在4～6 h的GP均迅速增加，發酵9 h后青稞糟和玉米酒精糟GP均高于其他酒糟，發酵效果好。由表2可知，發酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟GP、理論最大產氣量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，而醬香型發酵酒糟GP顯著低于其他酒糟(P<0.05)。玉米酒精糟產氣速率顯著低于其他酒糟(P<0.05)。啤酒糟產氣延滯時間顯著高于其他酒糟(P<0.05)，玉米酒精糟產氣延滯時間顯著低于其他酒糟(P<0.05)。

圖1 不同類型酒糟GP的動態變化

表2 不同類型酒糟發酵24、48和72 h GP以及72 h產氣動力學參數

2.3 不同類型酒糟發酵的TVFA和VFA比例

由表3可知，發酵24和72 h，青稞糟TVFA濃度顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發酵24和48 h，青稞糟和玉米酒精糟乙酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)，發酵48 h，啤酒糟乙酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟丙酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發酵24 h，青稞糟丁酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發酵48 h，醬香型發酵酒糟丁酸/TVFA顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發酵72 h，啤酒糟丁酸/TVFA顯著低于其他酒糟(P<0.05)。發酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟乙酸/丙酸顯著低于其他酒糟(P<0.05)。

表3 不同酒糟發酵24、48和72 h的VFA比例

2.4 不同類型酒糟的NH3-N濃度和MCP含量

由表4可知，不同酒糟發酵液pH在6.60～6.80。發酵48和72 h，啤酒糟和青稞糟NH3-N濃度顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發酵24 h，青稞糟MCP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，啤酒糟MCP含量顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發酵72 h，玉米酒精糟MCP含量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表4 不同類型酒糟發酵24、48和72 h的NH3-N濃度和MCP含量

2.5 不同類型酒糟的H2、CH4和CO2產量

由表5可知，發酵24和48 h，青稞糟和玉米酒精糟H2產量顯著高于其他酒糟(P<0.05)，發酵72 h，玉米酒精糟H2產量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。發酵24 h，醬香型酒糟CH4產量顯著高于其他酒糟(P<0.05)；發酵72 h，醬香型發酵酒糟和濃香型酒糟CH4產量顯著低于其他酒糟(P<0.05)。發酵24 h，醬香型發酵酒糟CO2產量顯著低于其他酒糟(P<0.05)；發酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟CO2產量顯著高于其他酒糟(P<0.05)。

表5 不同類型酒糟發酵24、48和72 h的H2、CH4和CO2產量

2.6 不同類型酒糟營養成分與發酵72 h VFA比例和CH4產量的相關性分析

由表6可知，CP、NDS含量和(NDS-Ash)/CP均與丙酸/TVFA和CH4產量呈顯著正相關(P<0.05)，與丁酸/TVFA呈顯著負相關(P<0.05)。NDS含量和(NDS-Ash)/CP與TVFA濃度呈顯著正相關(P<0.05)。NDF和ADF含量均與丁酸/TVFA呈顯著正相關(P<0.05)，與TVFA濃度、丙酸/TVFA和CH4產量呈顯著負相關(P<0.05)。

表6 營養成分與發酵72 h VFA比例和CH4產量的相關性分析

3 討 論

3.1 不同類型酒糟72 h GP及產氣動力學參數

不同類型酒糟作為發酵底物，GP具有明顯差異。GP在某種程度上可反映瘤胃微生物的降解活性和飼料降解率[17]，通常情況下，含結構性碳水化合物較多的粗飼料GP最高峰在48 h以后出現[18]。青稞糟和玉米酒精糟發酵9～72 h GP高于其他酒糟，說明青稞糟和玉米酒精糟含有較多的可發酵成分和易發酵碳水化合物。本試驗濃香型酒糟、醬香型酒糟和醬香型發酵酒糟因含有大量稻殼，難降解碳水化合物含量高，GP低于其他酒糟。產氣動力學參數可以間接反映飼料在瘤胃中的消化情況，有研究發現理論最大產氣量與NDF消化性呈正相關[19]。而本試驗中NDF含量較低的青稞糟和玉米酒精糟理論最大產氣量較高，可能原因是其可消化降解性較高。產氣延滯時間可以代表飼料在體內利用的難易程度，延滯時間越長，利用越慢[20]。本試驗中，啤酒糟產氣延滯時間高于其他酒糟，玉米酒精糟則與之相反，表明玉米酒精糟與其他酒糟相比，在體內更容易被利用。而啤酒糟可能是因為其蛋白質品質較差，蛋白質消化吸收率較低[21]，導致延滯時間最高。

3.2 不同類型酒糟24、48和72 h的發酵參數及CH4產量

瘤胃pH是衡量瘤胃發酵狀況的重要指標，一般為6～7[22]，本研究結果均在此范圍內。飼料組成不同，VFA含量和比例也會有差異。6種酒糟中，發酵48和72 h青稞糟TVFA濃度最高，其次是玉米酒精糟和啤酒糟，醬香型發酵酒糟最低，提示青稞糟、玉米酒精糟和啤酒糟在為反芻動物供能上可能優于其他酒糟，而醬香型發酵酒糟最差。根據乙酸/丙酸可知，啤酒糟、青稞糟和玉米酒精糟為偏丙酸型發酵，醬香型發酵酒糟、醬香型酒糟和濃香型酒糟為偏乙酸型發酵。NH3-N濃度能間接反映瘤胃微生物分解飼料CP產生NH3-N和利用NH3-N合成MCP的平衡情況[23]。瘤胃NH3-N濃度一般為6～30 mg/dL[24]，考慮到體外發酵過程中產生的NH3-N不能經瘤胃上皮吸收，所以發酵72 h出現啤酒糟和青稞糟NH3-N濃度略超出范圍的現象。MCP是反芻動物最主要的蛋白質來源，能提供反芻動物所需氨基酸的50%以上[25]，此外，MCP含量高低還可反映培養體系中微生物種群的數量、活力及其利用NH3-N的能力[26]。青稞糟和玉米酒精糟NH3-N含量較高，表明青稞糟和玉米酒精糟作為發酵底物時，其發酵液中微生物數量和活力高于其他酒糟。用生物發酵來改善低質粗飼料營養價值是目前備受推崇的方法，其中醬香型發酵酒糟經微生物固態發酵產生了MCP，所以與醬香型酒糟相比，CP含量增加。雖然醬香型發酵酒糟在供能方面較差，但發酵24和48 h NH3-N濃度高于醬香型酒糟和濃香型酒糟，MCP含量高于濃香型酒糟和啤酒糟，說明醬香型發酵酒糟在反芻提供動物蛋白質方面具有一定的潛力。

對于反芻動物來說，CH4不僅會造成環境的污染，還會降低飼料能量的利用[27]。瘤胃發酵的最初階段主要以CO2-H2還原生成CH4途徑為主[28]，H2是生成CH4的主要前體物質，發酵48和72 h，青稞糟和玉米酒精糟CH4產量高于其他酒糟，一方面可能是其H2和CO2產量較高，促進CH4的產生，另一方面可能是其更有助于甲烷菌的生長[29]。這暗示青稞糟和玉米酒精糟在反芻動物上飼喂時，以甲烷能損失的能量可能高于其他酒糟，易造成能量的浪費，且不利于減排。

3.3 不同類型酒糟營養成分與VFA比例和CH4產量的相關性分析

纖維成分是影響CH4產量的一個主要方面，CH4產生主要源于纖維物質的降解[30]。而本試驗結果NDF、ADF含量與CH4產量呈負相關，這與前人研究結果[31-32]一致。造成這種結果的原因可能是體外模擬瘤胃發酵產氣不能完全代替體內瘤胃動態產氣效果，因為體內瘤胃CH4可以通過噯氣排出，達到CH4平衡目的。本試驗發現隨著NDF含量降低，丙酸/TVFA升高，這與前人研究結果[33-34]相同。NDS主要包括淀粉、脂肪、CP和礦物質元素等，脂肪和礦物質發酵對產生NH3-N、MCP、VFA和GP等發酵結果不做貢獻，基本上可以忽略不計，而淀粉作為重要的碳水化合物，影響反芻家畜的發酵模式，高淀粉含量傾向于丙酸生成，反之傾向于乙酸生成[35]。試驗結果表明NDS/CP與VFA比例、CH4產量沒有相關關系，而NDS含量、(NDS-Ash)/CP與TVFA、丙酸/TVFA和CH4產量呈顯著正相關關系。這可能是因為酒糟中一般含有較多的非淀粉多糖、酵母細胞和酵母細胞成分等物質[36-37]，且有研究發現隨著酵母培養物添加量的增加，CH4產量呈二次降低的趨勢[38]，由于這些成分的影響，從而導致了與其他研究結果[39]相反的正相關關系。

4 結 論

① 青稞糟和玉米酒精糟產氣參數和發酵參數結果均高于其他酒糟，啤酒糟次之。醬香型發酵酒糟GP和CH4產量最低，且其他瘤胃發酵參數結果較好。醬香型酒糟和濃香型酒糟GP和發酵參數結果均較低，其進一步發酵加工后再飼用更佳。

② TVFA、VFA比例和CH4產量受不同類型酒糟營養成分的影響，相關性分析表明，TVFA濃度主要受NDF、ADF、NDS含量和(NDS-Ash)/CP的影響，CH4產量受CP、NDF、ADF、NDS含量和(NDS-Ash)/CP的影響。