銅銦硫三元量子點的合成及在生物領域的應用 *

劉美娜，馬小芳，李程豪，童金輝，周桂江，關曉琳

(1. 西北師范大學 生態環境相關高分子材料教育部重點實驗室甘肅省高分子材料重點實驗室 化學化工學院，蘭州 730070;2. 甘肅中醫藥大學 基礎醫學院，蘭州 730000; 3. 西安交通大學 理學院應用化學系，西安 710049)

0 引 言

作為在“2016新材料資本技術春季峰會”上發布的20大未來最具潛力新材料之一的量子點(quantum dots, QDs)，是一種極小的半導體納米晶體，呈現出特殊的光、電、磁學性質，在醫學、太陽能電池、顯示照明等領域前景巨大[1-4]。特別是自2014年底，TCL在北京推出新品H9700 QDs電視，并在中國市場取得不俗的銷售業績，更使QDs的開發研究進入空前白熱化。

QDs是一類球形或準球形納米粒子，它具有1～10 nm的穩定直徑，且由半導體材料制成(通常由Ⅱ-Ⅵ，Ⅲ-Ⅳ或Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ元素組成)[5-6]。QDs由于其獨特的光學性質，如高亮度、發射光波長可調、激發光譜寬、發射光譜窄、熒光壽命長和抗光漂白性高等優勢，在近幾十年內一直引起廣泛關注。

80年代初期，貝爾實驗室的Louis Brus博士，前蘇聯Yoff 研究所的Alexander Efros和Victor.I. Klimov 博士[7]在研究 QDs尺寸時均發現：不同粒徑尺寸的硫化鎘(CdS)QDs發射的熒光顏色是不一樣的，如圖1所示。這種有趣的實驗現象可用“量子限域效應”解釋，且QDs尺寸與發光顏色之間存在特定的變化規律。該研究結果加速了QDs的發展，各種結構性能的QDs材料被相繼開發和應用。

圖1 QDs的熒光隨尺寸增大發生紅移現象Fig 1 Red shift in the fluorescence emission peak with respect to the increase in quantum dot size

研究早期，QDs主要是在有機相中合成，制備過程中需要復雜的前驅體及較高的溫度[8-9]，導致合成條件苛刻，步驟繁瑣，操作難度高，且制備所得QDs材料水溶性較差，限制了其在生物醫學領域的廣泛應用[10-11]。研究者為了提高QDs的水溶性和生物相容性，最初采用通過在QDs表面進行配體交換和接枝修飾的方法將有機相轉化為水相[12-16]。其中最常用的方式是將一些具有生物相容性的功能分子接枝修飾于QDs表面，達到增強原有QDs的水溶性和生物相容性的目標。例如，1988年Paul Alivisatos和Warren Chan兩位教授課題組[17-18]分別通過改良CdSe/ZnS QDs的合成方法，將水溶性的二氧化硅殼接枝在表面，并與生物大分子生物素(C10H16N2O3S)結合，將其應用于3T3 cells(小鼠成纖維細胞)中獲得良好的熒光顯影效果，成功實現QDs在活細胞體系中的熒光成像，如圖2所示。這一成果發表在了Science上，引起廣泛關注。

圖2 CdSe/ZnS QDs在小鼠成纖維細胞中的成像圖Fig 2 CdSe/ZnS QDs imageing in 3T3 cells

但是，QDs在上述由油相向水相的轉化過程中，熒光量子產率(PLQY)和穩定性均會發生明顯的降低，影響QDs的實際應用效果[19-22]。而與有機相合成方法相比，QDs的水相合成方法具有操作簡單、過程環保、成本低廉以及生物相容性良好等優勢，是合成QDs的最佳方法。例如，佛羅里達州立大學Hedi Mattoussi教授課題組[23-24]利用親水性聚合物在水相中通過一步法制備出高量子產率和光穩定好，并具有多個反應位點的QDs復合材料。南京郵電大學材料科學與工程學院的汪聯輝教授發展了基于聚合物/QDs納米復合物光電材料的新型生物傳感器及其檢測技術，并成功用于生物分子的高靈敏、高特異性檢測[25- 26]。本課題組在環境友好水溶性聚合物/QDs納米復合材料及多類型聚合物高效修飾QDs方面也開展了一些研究，并已研制出檢測環境水樣中痕量重金屬離子及溶解性有機質的QDs熒光探針[27-28]。

目前，研究較多的主要是Ⅱ-Ⅵ二元族QDs，例如CdS、CdTe、CdSe、CdS /ZnS、CdSe/ZnS QDs等。但是由于其中重金屬離子Cd2+的釋放會產生很高毒性，對環境和人類的身體健康造成不同程度的影響，如Cd2+或Pb2+等重金屬元素在細胞中聚集最終將導致細胞死亡[29]。因此，開發不含有毒重金屬元素的QDs來替代基于Cd2+或者Pb2+的二元QDs具有重要的研究和應用價值。

Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ型QDs，是近些年出現的一種新型QDs，克服了傳統QDs包含對環境和生物體系毒性較大的重金屬元素(鎘或鉛)的問題，可以有效地降低QDs的生物毒性和對環境污染，擴大了QDs的應用范圍[30-31]。其中，CuInS2由于無毒，太陽光吸收系數高，光化學性能穩定且熒光波長涵蓋從可見光區到近紅外區，是一種非常理想的太陽能電池和生物光學成像材料[32]。

CuInS2QDs具有QDs特有的帶隙結構，其結晶結構有兩種，分別是斜方晶型結構和四方黃銅礦結構，對應的帶寬分別1.98和1.87 eV[33]。基于CuInS2QDs特殊的發光機理，其熒光光譜可以覆蓋整個可見光和部分近紅外區域，發射出的光子可以通過滲透生物體組織并減小生物體的自熒光所帶來的干擾[34-35]。同時，CuInS2QDs具有大的斯托克斯位移，長的熒光壽命，較長的發射波能減少外界激發波帶來的干擾，有利于生物成像應用。此外，與傳統的二元QDs相比，CuInS2QDs沒有明顯的第一激子峰，在可見光和近紅外區域吸光系數很大，且平均熒光壽命普遍比二元QDs高[36]。并且，CuInS2QDs可以在較為溫和的條件下合成[37]。因而，近年來越來越多的研究者選用CuInS2量子點作為研究及應用對象，以達到降低毒性、環保的效果，從而滿足當前對環境友好型材料的戰略要求[38-41]。尤其在生物應用領域被視為最具潛力的新型QDs材料。

1 CuInS2 QDs的合成

目前，CuInS2三元QDs的合成方法主要包括有機相和水相兩種方式。有機相合成是目前研究的主導，而水相合成也越來越得到研究者的青睞，兩種方法具有各自的優點，并被不斷發展和完善。

1.1 油溶性CuInS2 QDs的合成

1993年時，Hirpo等[42]首先制備出含有Cu, In, S三種元素的前驅體(PPh3)2CuIn(SEt)4，隨后通過熱解重量分析法得到了一種新型CuInS2三元QDs。然而該方法中前驅體的轉變過程較為復雜。 2003年，Castr課題組[43]首次通過在200～300 ℃下熱分解前驅體(PPh3)2CuIn(SEt)4的方法，制備出尺寸較小、具有黃銅礦結構的CuInS2QDs。2008年時，Gardner課題組[44]改用微波照射前驅體(PPh3)2CuIn(SEt)4成功合成了CuInS2QDs。上述方法都是在一定條件下以金屬有機分子(PPh3)2CuIn(SEt)4為前驅體，采用一定的方式將三種元素分解出來從而制備CuInS2QDs。但是，由于前驅體(PPh3)2CuIn(SEt)4制備過程繁瑣，反應成本過高，并具有一定的毒性，不利于大規模合成CuInS2QDs類材料。

此后，研究者又陸續開發出一些新的方法制備CuInS2QDs，包括微波協助法[45]、熱注法[46]以及熱溶劑法等[47]。2008年時，北京理工大學的鐘海政教授課題組[48]以乙酸銦和乙酸亞銅為原料，烷基硫醇為硫源在高溫240 ℃下制備出CuInS2QDs，并通過改變反應溫度和時間有效控制CuInS2QDs的尺寸和光學特性。這種方法避免了復雜結構前驅體(PPh3)2CuIn(SEt)4的制備。2016年，Prashant教授課題組[49]通過改變金屬離子Cu/In的比例，實現了對CuInS2QDs發光顏色的有效調控。

此外，研究者常通過在QDs表面進行殼層包覆或制備合金的方式進一步提高CuInS2QDs的PLQY和發光穩定性[50-51]。例如，2011年，Heesun Yang等[52]在230 ℃下，將陽離子前驅體碘化亞銅(CuI)和乙酸銦，以及配體正十二硫醇加入溶劑1-十八烯中反應5 min，先形成CuInS2量子點核，然后注入Zn前驅體硬脂酸鋅溶液，在240 ℃下反應1 h后在CuInS2量子點核表面形成ZnS殼層，即得到核殼結構的CuInS2/ZnS量子點，其量子效率高達78 %。

目前，大多數CuInS2QDs的合成是在有機溶劑及高溫條件下進行的[53-54]。這種“有機相合成法”需要高溫儀器設備，實驗操作難度較高，且制備出的CuInS2QDs具有很強的親油性，水溶性很差，難于在含水的生物環境中應用。而增強上述CuInS2QDs親水能力的常用方法是通過配體交換或者在QDs表面接枝親水性的聚合物來實現。但在此轉化過程中顯著延長了材料合成周期，提高了制備成本。因此，通過直接在水溶液中合成CuInS2QDs是獲得此類水溶性材料的最佳選擇。

1.2 水溶性CuInS2 QDs的合成

1.2.1 一步水相合成法

與前述有機相合成方法不同的是，水相合成法步驟少，操作簡單，有效避免后期的純化和修飾過程，所得QDs具有優異的水溶性，可被直接應用于生物領域[55-58]。迄今為止，水相合成CuInS2QDs的配體及穩定劑大多為兩親性分子，如巰基丙酸(MPA)、巰基乙酸(TGA)等小分子。例如，2014年，吉林大學的蘇星光課題組[59]以氯化銅(CuCl2)、氯化銦(InCl3)和硫脲(CS(NH2)2) 為原料，MPA為配體，在150 ℃及pH=11的條件下，通過在反應釜中反應21 h，成功制備出發紅光的水溶性CuInS2QDs。同年，Zhou等[60]以CuCl2、InCl3和硫化鈉(Na2S)為原料，巰基乙酸(TGA)為配體在130 ℃下反應7h，得到了結構為纖維鋅礦晶型的水溶性的CuInS2QDs。

然而，由于含有巰基的小分子具有強烈的刺激性氣味，在實驗和后期處理過程中會釋放出毒性氣體，危害科研人員的身體健康。因此，開發低毒或無毒的高效配體是水相合成法制備CuInS2QDs急需解決的問題。目前，已有一些有效的低毒性配體被報道，例如，Gao課題組[61]以CuCl2、InCl3和CS(NH2)2為原料，L-谷氨酸(PGA)為配體在150 ℃、pH=11.3的條件下在反應釜中反應21 h，制備得到水溶性的CuInS2QDs，然后將其與抗癌藥物阿霉素(DOX)結合制備得到功能化的量子點CuInS2-PGA-DOX。由于DOX可通過電子轉移淬滅CuInS2QDs的熒光，從而導致CuInS2QDs處于熒光“關閉”狀態。而當CuInS2-PGA-DOX納米顆粒被癌細胞吞噬后，由于水解釋作用釋放出DOX，激活CuInS2QDs進入熒光“開啟”狀態。因此，CuInS2-PGA-DOX納米顆粒不僅可以將抗癌藥物DOX有效傳遞至目標癌細胞中，并且通過CuInS2QDs的熒光“開啟”信號強弱變化，實時監控抗癌藥物DOX的釋放情況，有望實現診療一體化，在癌癥治療的臨床應用方面發揮作用，如圖3所示。

雖然，通過水相合成法制備CuInS2QDs，有效的克服了有機相中實驗條件苛刻、制備過程繁瑣和產品水溶性差等難題，但在應用中卻存在PLQY低、穩定性差等缺陷。因此，研究者們仍然在不斷嘗試開發新的水相配體，以及改進合成方法，期望獲得發光性能更加優異的水溶性CuInS2QDs，滿足生物醫學領域的應用需求。

1.2.2 油溶性CuInS2QDs的表面親水修飾

由于有機相合成法制備的CuInS2三元QDs熒光性能優異，因此，目前大部分的高質量QDs仍采用此方法來合成，然后通過三種方法解決因其表面大量疏水基團存在而導致的親水性差，無法有效在生物醫學領域應用的難題[62]。第一種方法是配體交換法，顧名思義就是將QDs表面的疏水基團交換為親水基團。Zhao等[63]用CuI、醋酸

銦(In(Ac)3)和Zn(Ac)2為原料，在230 ℃下合成了表面含有疏水性油酰胺(OLA)結構的高效發光CuInS2/ZnS核殼QDs，PLQY高達70%。隨后，基于MPA對量子點表面具有更高的表面親和能力，從而通過配體交換取代CuInS2/ZnS QDs表面的OLA。緊接著，又通過GSH與MPA之間的配體交換，成功獲得表面含有GSH的親水性CuInS2/ZnS QDs，最終實現其從有機相向水相的轉移，轉化過程如圖4所示。但是，遺憾的是，經過兩次配體轉化，CuInS2/ZnS QDs的PLQY從最初的70%降至34%。由此可見，雖然可以通過上述配體交換法，制備水溶性CuInS2QDs，但是在配體轉化過程中，原有QDs PLQY會被大大降低，進而影響其發光效率，降低材料的應用價值。因此，如何在實現高性能油溶性CuInS2QDs向水溶性轉變的同時，還能保留其原有的高發光特性是研究者們繼續努力的目標。

圖4 水溶性CuInS2/ZnS QDs表面配體交換過程(a、b、c)乳腺腫瘤細胞成像Fig 4 Ligand exchange process on the surface of water-soluble CuInS2/ZnS QDs, (a, b,c) imaging in MCF10CA1a breast tumor cells

第二種方法是膠束法。例如，Deng等[64]在230 ℃下用油胺為穩定劑合成了油溶性的CuInS2/ZnS QDs，隨后將合成的N-琥珀酰N'-辛基殼聚糖膠束(FA-SOC)接枝在CuInS2/ZnS QDs表面，合成了表面含有大量親水基團的水溶性CuInS2QDs，修飾后的QDs保留了初始CuInS2/ZnS QDs的形貌、晶體結構和發光特性。最后，Deng又在其表面鍵合大量葉酸分子，制備出具有靶向功能的量子點CuInS2/ZnS-FA-SOC，以其作為高效熒光顯影劑，有效應用于體內和體外熒光成像。

第三種方法是聚合物表面修飾。聚合物具有機械性能良好、質量輕、物理化學性質穩定、易于加工成型等優點，是對QDs表面進行修飾的優良材料。 被聚合物修飾后的QDs，一方面可以通過聚合物分子鏈之間的排斥作用有效防止QDs之間的團聚，另一方面通過聚合物優異的加工性能，制備成各種尺寸器件，在太陽能電池、生物探針等領域有著良好的應用前景[65-66]。在已報道的文獻中，CuInS2QDs表面的聚合物修飾方式主要有兩種，一種是通過疏水或者靜電等弱作用力，將QDs材料分散在聚合物的基體之中，這種方法叫做共混法；另一種方法是通過化學反應用強的共價鍵將QDs與聚合物緊密結合在一起，這種方法叫做鍵合法。最初因共混法操作簡便而備受青睞，但制備出的材料尺寸分布不均一，且表面易團聚的問題使材料在實際應用中完全或部分喪失其特有的價值。與之相比，鍵合法制備的材料尺寸均一且表面粘合度較高，是目前聚合物接枝修飾QDs的主要方法[67]。其中，當QDs被用于生物成像或生物診斷等生命學科時，選取的基體材料是具備生物相容性及水溶性的聚合物，如聚乳酸(PLA)[68]、聚丙烯酸(PAA)[69]、聚乙二醇(PEG)[70]等。例如， 2017年，Yang等[71]在合成的CuInS2/ZnS QDs表面通過鍵合法將二乙烯三胺五乙酸(DTDTPA)沉積到CuInS2/ZnS QDs表面，然后再將Gd3+螯合，制備出CuInS2/ZnS共軛釓復合物(CuInS2/ZnS QDs@DTDTPA-Gd)，用于近紅外熒光和t1加權MR雙峰成像(圖5)。

圖5 CuInS2/ZnS QDs @DTDTPA-Gd的制備 Fig 5 Preparation of CuInS2/ZnS QDs @DTDTPA-Gd

上述三種方法相比，第一種配體交換法能夠有效保證QDs的小尺寸和良好的分散性，更有利于生物熒光成像。但是，配體交換過程仍需在有機相中進行，反應溫度較高，操作難度大，同時交換后PLQY有一定程度的損失。而后兩種方法會增大QDs的尺寸影響其生物應用效果。

2 CuInS2三元QDs在生物領域的應用

近年來，由于CuInS2QDs優良的發光特性、強的光穩定性和良好的抗光漂白性能，更因為其表現出的低毒環保特性，其已被視為理想的綠色光學材料而被廣泛應用于生物領域，尤其是在生物分子檢測和細胞成像方面展現了巨大的應用潛力。

2.1 生物體系中對離子及分子檢測應用

CuInS2QDs的熒光性質具有隨著某種外界環境或外界物質含量改變而變化的特性，因此，可通過對某種生物分子的敏感響應性能進行定量分析和檢測。而與其它傳統的生物熒光分子探針相比，CuInS2QDs具有連續激光光譜寬、對稱發射光譜窄、光化學穩定性高和發光顏色可控等優勢。更重要的是，其低的生物毒性和生物相容性使CuInS2QDs更有利于在生物體中應用。

例如，蘇星光課題組[72]采用MPA為穩定劑使用一步水熱法合成發射波長在670 nm的CuInS2QDs，并通過一系列表面功能化修飾，實現對溶菌酶、多巴胺分子、磷酸酶、2,4,6-三硝基苯酚等多分子的檢測。在檢測溶菌酶時，因為聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDAD)可以使CuInS2QDs的熒光猝滅，而溶菌酶分子易于通過靜電作用與PDAD結合而使熒光恢復，從而起到有效檢測溶菌酶的作用，其檢出限可達到6 nmol/L。其次，還可利用CuInS2QDs表面的3-氨基苯硼酸與多巴胺分子反應生成硼酯鍵，引起QDs熒光淬滅，從而實現對生物分子多巴胺的有效檢測，該方法的檢出限可低至0.02 μmol/L。同時，由于雙氰胺可以與2，3-丁二酮反應生成具有鄰位二羥基結構的環化產物，該物質可以與3-氨基苯硼酸反應生成硼酯鍵，引起QDs熒光淬滅，可以對牛奶中的雙氰胺進行定量檢測，檢出限為0.6 μmol/L。此外，表面經色氨酸修飾后的CuInS2QDs，可與堿性磷酸酶發生去磷酸化作用，從而實現對癌癥腫瘤標志物堿性磷酸酶的檢測，其檢出限可達到3.6 nU/mL。最后，表面經牛血清蛋白修飾后的CuInS2QDs可與2,4,6-三硝基苯酚(TNP)發生相互作用，從而建立了一種檢測2,4,6-三硝基苯酚的有效方法，其檢出限可達到 28 nmol/L。

Liu等[73]采用一鍋水熱法將氨基酸L-半胱氨酸(cys)接枝修飾于CuInS2QDs表面，合成了平均粒徑為3.3 nm，尺寸均一，

熒光穩定，發射波長在656 nm的Cys-CuInS2QDs。當在其水溶液中加入Cu2+后，由于Cys-CuInS2QDs表面半胱氨酸的胺基與Cu2+之間的發生電子轉移，導致Cys-CuInS2QDs表面無輻射e-/h+發生了重組，從而造成Cys-CuInS2QDs的熒光發生猝滅，如圖6所示。此外，Liu利用β-葡萄糖苷酶(β-Glu)降解生氰苷Amy，使其轉化為游離CN-，再基于CN-與Cu2+的結合作用，干擾Cys-CuInS2QDs與Cu2+之間的電子轉移過程，從而使熒光得以恢復，以此建立一種簡便且可逆的檢測β-Glu的熒光方法。另一方面，在β-Glu抑制劑的存在下，β-Glu活性被抑制，系統熒光將再次保持“熄滅”狀態。因此，Cys-CuInS2QDs也可被用于對β-Glu抑制劑的篩選。圖6為“開關型”熒光納米顆粒探針用于β-Glu測定及其抑制劑篩選的示意圖。

圖6 “開關型”熒光納米顆粒用于β-Glu測定和制劑篩選的示意圖Fig 6 Schematic diagram of fluorescent “on-off” nanoprobe for β-Glu determination and inhibitor screening

此外，Liu等[74]研究對比了18種氨基酸對CuInS2/ZnS QDs的修飾效果，發現半胱氨酸(Cys)與蘇氨酸(Thr)協同修飾后所得CuInS2/ZnS QDs的PLQY最佳。該QDs平均粒徑為4.8 nm, 發射波長為710 nm，位于近紅外區。隨后他們系統研究該CuInS2/ZnS QDs對Cd2+的熒光響應效果和機理。研究結果表明，隨著CuInS2/ZnS QDs溶液中Cd2+濃度的不斷增大，體系熒光出現明顯的增強現象，且Cd2+的濃度于熒光強度呈現出良好的線性關系。機理研究進一步表明，由Cys和Thr修飾的CuInS2/ZnS QDs外層的Zn2+可與Cd2+發生陽離子交換而被取代，而表面形成的CdS由于減少了電子-空穴相互作用，導致熒光強度顯著增強，從而實現對Cd2+的靈敏檢測，其檢出限可達到7.8 nmol/L。此外，Liu等進一步研究了CuInS2/ZnS QDs在A549肺癌細胞中對Cd2的檢測情況及多色成像的效果，如圖7所示。CuInS2/ZnS QDs在710 nm處發射紅色熒光，隨著體系中Cd2+的濃度增加熒光增強，從而到達了在細胞中有效檢測Cd2+的效果。

圖7 半胱氨酸和蘇氨酸協同修飾CuInS2/ZnS QDs的合成及其在Cd2 +定量和多色成像中的應用Fig 7 Synthesis of Cys- and Thr- Capped CuInS2/ZnS QDs and their applications in Cd2+ quantification and multicolor imaging

2019年，Li等[75]首先合成一種發射峰位于638 nm附近(紅色熒光)，PLQY高達28.6 %的CuInS2/ZnS QDs，然后用配體谷胱甘肽(GSH)對其進行修飾，以增強其水溶性，修飾后的QDs發射峰藍移至520 nm附近 (綠色熒光)。接著將Ce3+偶聯于該QDs表面，產生熒光猝滅效應。再通過ATP與金屬離子Ce3+較強的結合能力，將QDs表面的Ce3+解離出來，恢復QD原有熒光強度。因此，可通過這種簡便的陽離子交換策略，實現對生物分子ATP的靈敏檢測，示意圖如圖8所示。最后，他們將Ce3+偶聯的CuInS2/ZnS QDs與人胚胎成纖維細胞(HELF)和腫瘤Hela細胞共孵育，通過在共聚焦顯微鏡觀察熒光強弱變化情況。研究結果表明，由于正常細胞HELF中ATP含量較低，QDs與HELF共孵育后，在細胞成像過程中沒有獲得強熒光信號。但是，由于在腫瘤細胞中ATP含量較高，通過與QDs表面Ce3+的偶聯作用，使熒光增強，從而在Hela細胞中觀察到較強的熒光信號。此外，Ca2+可以激活線粒體中脫氫酶以促進ATP的產生。在用Ca2+處理過的Hela細胞中，由于ATP含量增高，在細胞成像中獲得最強的熒光信號， 因此，該研究為監測癌細中ATP水平提供了一種有效方法和熒光探針材料。

圖8 (a) 探針CuInS2/ZnS QDs的制備、(c、d、e)不同濃度的Ce3+、ATP的熒光圖以及校準曲線、(b)正常細胞和癌細胞中的成像對比Fig 8 (a) Preparation of CuInS2/ZnS QDs Probe, (c, d,e) fluorescence graphs and calibration curves of Ce3+ and ATP at different concentrations, (b) imaging contrast of HELF cells and Hela cells

綜上所述，各種各樣表面功能化的CuInS2QDs在生物檢測領域已取得了一定的效果，但是目前仍然面臨一些問題，例如：與其它熒光生物探針相比，水溶性CuInS2QDs具有發光效率較低，檢出限較高等缺陷。研究者們還需要通過各種方法來解決這個長期的問題，從而提高CuInS2QDs作為熒光探針在生物檢測中的應用價值。

2.2 生物成像應用

迄今為止，大量研究表明，QDs可以通過與生物大分子偶聯而融入到細胞體內，實現對活細胞、蛋白質和DNA等生命物質進行長時間的熒光標記，使得QDs在臨床診斷和藥物篩選等領域表現出巨大的應用前景。但是，傳統含重金屬Cd2+的QDs由于具有高的生物毒性，限制了其在生物醫學鄰域的廣泛應用。相比之下，CuInS2QDs的生物毒性較低，熒光壽命長，且發光顏色可覆蓋部分近紅外區，有利于穿透組織層進行深組織成像，同時可大大降低生物組織由于自發熒光而產生的干擾。因此，相比于其它類型的熒光探針材料，CuInS2QDs在生物成像(體內和體外)應用方面具有獨特的優勢和巨大的潛力。

2.2.1 體外成像應用

近年來，由于具有近紅外(NIR)發光性能的CuInS2QDs表現出優異的光穩定性、高的熒光效率、深的組織穿透能力和低的生物毒性等優勢，已被廣泛應用于近紅外熒光成像領域。例如，Su等[76]首先以CuCl2和InCl3為金屬前體，CS(NH2)2為硫源，MPA為配體，在150 ℃、pH=11的條件下反應21 h制備水溶性的CuInS2QDs，然后將即具有載藥能力又具有靶向能力的跨膜分子MUC1-(CGA)7適體鍵合于CuInS2QDs表面，最后將抗癌藥物DNR(柔紅霉素)修飾到CuInS2QDs表面，實現了對PC3M cells(人前列腺癌細胞)和HepG2 cells(肝癌細胞)的診療一體(圖9)。

圖9 DNR-MUC1-CuInS2 QDs的制備、(A)前列腺細胞成像、(B)肝癌細胞成像、(C)細胞存活率Fig 9 Preparation of DNR-MUC1-CuInS2 QDs, (A) imaging in PC3M cells, (B) imaging in HepG2 cells, (C) Cell viability

Hu等[77]首先以CuCl2、InCl3·4H2O和Zn(Ac)2為金屬前體，Na2S為硫源，MPA為配體合成CuInS2/ZnS QDs，然后采用“微流控芯片法”將變性的牛血清蛋白(dBSA)修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，合成了生物相容性良好的dBSA-CuInS2/ZnS QDs，其發射波長位于近紅外范圍內，且可通過調整反應條件使其波長從650 nm紅移至750 nm。此外，dBSA-CuInS2/ZnS QDs呈現較長的熒光壽命(153.66 ns)。為了進一步的探究dBSA-CuInS2/ZnS QDs在生物成像中的適用性，該課題組將具有靶向功能的葉酸分子和透明質酸修飾在dBSA-CuInS2/ZnS QDs表面，研究其對巨噬細胞(RAW264.7 cells)、肝癌細胞(HepG2 cells)和胰腺癌細胞(Panc-1 cells)的細胞毒性和成像效果。結果表明，dBSA-CuInS2/ZnS QDs具有較低的細胞毒性和對腫瘤細胞良好的靶向成像功能。這種基于“一步式”的合成方法提供了一種快速、簡便且廉價的三元QDs納米晶體合成方式(圖10)。

圖10 (a) dBSA-CuInS2/ZnS QDs的制備、(b)巨噬細胞成像、(c)肝癌細胞成像、(d)胰腺癌細胞成像Fig 10 (a) Preparation of dBSA-CuInS2/ZnS QDs, (b) imaging of RAW264.7 cells, (c) imaging of HepG2 cells, (d) imaging of Panc-1 cells

最近，Chen等[78]基于水溶性聚合物PEG合成一種具有良好生物相容性的新型PEG-CuInS2/ZnS QDs，并系統研究該三元QDs的毒理學特征，尤其是免疫毒性。他們使用DC2.4細胞系(小鼠骨髓樹突狀細胞)對PEG-CuInS2/ZnS QDs進行了體外細胞毒性研究，同時進行了BALB/c小鼠(常見實驗小鼠)的體內免疫毒性測試。體外細胞實驗表明，PEG-CuInS2/ZnS QDs被DC2.4細胞吸收后可促進細胞活力，并增強腫瘤壞死因子-α的釋放，從而刺激脂多糖降低白介素6(IL-6)的水平(白介素6是炎癥早期的敏感性物質)。小鼠體內研究表明，PEG-CuInS2/ZnS QDs進入小鼠體內一天后即增加了白介素4(IL-4)(白介素4是過敏性和自身免疫性疾病的發病中起重要的作用)的水平，并在第28 d增強了白介素10(IL-10) (白介素10是炎癥與免疫抑制因子)和白介素13(IL-13) (白介素13是炎癥與免疫抑制因子)的水平。治療1與28 d相比，脾臟淋巴細胞的數量、器官指標、血液學和免疫器官組織無明顯差異，表明PEG-CuInS2/ZnS QDs在生物體內和體外都具有較低的毒性和很高的生物相容性，具有較高的生物應用潛力。PEG-CuInS2/ZnS QDs 對DC2.4細胞活力和細胞因子產生的體外影響如圖11所示。

圖11 PEG-CuInS2/ZnS QDs 對DC2.4細胞活力和細胞因子產生的體外影響Fig 11 In vitro effects of CuInS2/ZnS QDs on viability and cytokine production of DC2.4 cells

綜上所述，由于各種功能化的CuInS2QDs所發射的近紅外熒光具有優異的組織穿透能力和較低的背景熒光，且在細胞成像中表現出優異的熒光性質和較好的生物相容性，已被用于生物醫學診斷和治療中，具有相對比較成熟的發展。

2.2.2 體內成像

相比于生物體外熒光成像，活體熒光成像能夠實現將分子成像技術從體外轉移到動物體內，能夠更準確觀測活體動物內的基因表達和細胞活動，由此提供有關治療或疾病進展的生物學效應的最完整信息，對醫學及生物學研究意義重大。

實現體內生物熒光成像的關鍵是高性能熒光探針的使用。為了滿足生物體內應用要求，熒光探針材料必須具備以下幾點特性：(1) 強的親水性；(2) 低的生物毒性；(3)優異的生物相容性；(4)在生理pH條件下和在水中保持結構和熒光穩定性；(5)具有靶向功能，易于與生物標記物結合。因而，體外應用所報道的部分熒光探針，例如鎘基QDs材料，是無法滿足體內成像要求的。相比之下，親水性CuInS2QDs是一種高效發光的無毒半導體納米材料，具有在可見光和近紅外可調、光穩定性好、熒光效率高、組織穿透深、毒性低等優點，已被廣泛應用于生物體內近紅外熒光成像中。例如，Zhu等[79]用碘化亞銅、乙酸銦和生物分子核糖核酸酶A(RNAse-A)制備了水溶性的A-CuInS2QDs。該A-CuInS2QDs在小鼠成骨細胞(MC3T3-E1 cells)有良好的成像效果。為了進一步證實該A-CuInS2QDs在體內的成像應用效果，該課題組進一步將A-CuInS2QDs注射到小鼠體內，通過體內示蹤和體外成像技術在小鼠胃部監測到強的熒光信號，組片分析結果表明，該A-CuInS2QDs未使小鼠組織產生毒性效應，且具有良好的體內成像性能、強的組織穿透性和優異的光穩定性。

最近，Rama S. Verma等[80]首先用CuI、In(Ac)3和硬酯酸鋅(Zn(St)2)為金屬前體，1-十二烷硫醇(1-DDT)為配體在230 ℃下采用微波輔助法合成了油溶性的CuInS2/ZnS QDs，其PLQY高達76%。然后通過表面配體交換的方式將11-巰基十二酸(MUA)接枝修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，大大增加了CuInS2/ZnS QDs的水溶性。最后，他們又在該QDs表面鍵合大量葉酸分子，制備出具有靶向功能的量子點FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs。細胞實驗結果表明FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs對人卵巢畸胎瘤細胞(PA1 cells)表現出顯著的生物相容性，與商用熒光染料Hoechst相比具有更高的標記穩定性和更強的光穩定性。為了進一步證FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs在體內的成像效果，他們將B16F10(小鼠黑色素瘤細胞)選為小鼠體內的腫瘤細胞系，進行小鼠體內熒光成像實驗。測試結果表明，FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs在2 h內具有較高的葉酸受體陽性腫瘤靶向能力。此外，FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs可以深層穿透小鼠皮下黑色素瘤中且均勻分布。通過組織切片和血液學分析證明FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs在小鼠主要的器官和血液中未產生毒性效應，如圖12所示。該工作為CuInS2QDs在生物體內靶向成像和示蹤提供了新思路和方法。

圖12 第一步：MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備、第二步：FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備、第三步：生物體內和體外的靶向成像Fig 12 Step 1: preparation of MUA-CuInS2/ZnS, Step2: preparation of FA-MUA-CuInS2/ZnS QDs, Step3: targeted imaging in vivo and in vitro

目前，基于干細胞的修復和再生療法是當今生物技術與醫學行業最熱門的領域之一，而全面了解活體模型被移植干細胞的遷移，植入和再生能力對該領域的發展尤為重要。最近，Chetty等[81]利用所合成的NIR MSCs-CuInS2/ZnS QDs來標記臍帶間充質干細胞(MSCs)，標記效率達98%。他們首先采用微波輔助法在6 min內制備了以1-十二烷硫醇(1-DDT)為配體的 DDT-CuInS2/ZnS QDs，通過表面配體交換的方式將MUA接枝修飾在CuInS2/ZnS QDs表面，以增強CuInS2/ZnS QDs的水溶性。然后再在QDs表面標記MSCs，提高QDs的生物相容性。體內熒光跟蹤實驗表明，在患有肝損傷的小鼠尾靜脈注射MSCs-CuInS2/ZnS QDs后，經2 h QDs逐漸聚集在受傷的肝臟中。同時，MSCs-CuInS2/ZnS QDs的再生潛力是通過肝細胞周圍的門靜脈，膽管和肝動脈組成的門道來確認的。經過激光掃描共聚焦顯微鏡以及組織病理學和血液學分析證實，MSCs-CuInS2/ZnS QDs移植后3天未觀察到明顯的炎癥、壞死或者凋亡。MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備及其在生物體內和體外的成像潛能如圖13所示。該研究提出了一種可在急性肝損傷動物模型中無創跟蹤移植臍帶間充質干細胞(MSCs)的方法，為未來的圖像引導細胞療法提高了新思路。

圖13 MUA-CuInS2/ZnS QDs的制備及其生物體內和體外的靶向成像Fig 13 Preparation of MUA-CuInS2/ZnS QDs and targeted imaging in vivo and in vitro

CuInS2QDs因其優異的熒光性質而被越來越多的應用于生物體內成像，但CuInS2QDs在基于熒光/光聲成像技術的多合一治療腫瘤方面的應用報道較少。Liang等[82]首先合成一種核殼結構CuInS2/ZnS QDs，然后將一種親水性大分子藥物膠束mPEG2000-DSPE接枝于量子點表面，形成富含藥物的大尺寸納米粒子CuInS2/ZnS NMs-80和小尺寸納米粒子CuInS2/ZnS NMs-25。最后將兩種 QDs與小鼠乳腺癌細胞4T1 cells共孵育，探究其體外光療功效和細胞毒性，證實該QDs材料低的細胞毒性和良好的光療功效。接著，Liang等探究了CuInS2/ZnS NMs QDs在小鼠體內MOST成像(顯微光學切片斷層成像)以及PTT / PDT協同治療效果。他們先將乳腺癌細胞注入小鼠尾靜脈使其在小鼠體內形成腫瘤，隨后再注入CuInS2/ZnS NMs QDs，使其同時充當“間諜衛星”和“精密武器”的作用，在精確診斷的同時有效消除腫瘤。MOST成像結果表明，CuInS2/ZnS NMs QDs能夠清晰的顯示小鼠體內腫瘤大小，且CuInS2/ZnS NMs-25比CuInS2/ZnS NMs-80具有更長的腫瘤保留時間、更高的腫瘤吸收率和更深的腫瘤穿透力。此外，該課題組還深入研究了CuInS2/ZnS NMs QDs光誘導腫瘤消融的能力，證實在660 nm的單激光照射下，CuInS2/ZnS NMs QDs可以同時提供光熱和光動力效應，從而產生了有效的協同光療功效。因此，CuInS2/ZnS NMs QDs作為多功能納米藥物不僅具有很高的治療功效，且可通過成像技術無創檢測腫瘤部位的分布情況，具有作為一種精確治療癌癥納米藥物的巨大潛力。圖14是CuInS2/ZnS NMs在熒光/光聲成像技術的“多合一”治療腫瘤方面的應用示意圖。

圖14 CuInS2/ZnS NMs用作治療腫瘤納米藥物Fig 14 CuInS2/ZnS NMs are used as nanomedicine for the treatment of tumors Phototherapy

綜上所述，CuInS2QDs因其優異的發光性能和近紅外熒光強大的組織穿透力優勢，在生物體內示蹤、診斷和治療等方面發揮越來越重要的作用，漸漸成為生物成像及醫學診療的明星材料。

3 結 語

綜上所述，QDs因其特殊的光、電、磁學性質而受到了廣泛的關注和應用。其中CuInS2三元QDs因其不含毒重金屬元素且熒光性質穩定，被視為一種綠色無毒的環保型納米光學材料，在生物醫學領域被廣泛應用。一方面，基于CuInS2QDs熒光對某種特定生物分子的高靈敏響應性，而被廣泛應用于生物分子的定量分析檢測中。另一方面，基于CuInS2QDs熒光大的斯托克斯位移，長的熒光壽命以及近紅外發射帶來強的組織穿透能力，在生物成像(體內和體外)領域備受關注，并發揮越來越重要的作用。

迄今為止，雖然研究者們已在CuInS2QDs的生物功能化修飾和應用方面做出了很大的努力，也取得了較為理想的成果，但是要滿足生物醫學應用要求，還有很長的路要走。例如，目前在提高水溶性CuInS2QDs的PLQY以及更深層次的醫學應用研究遠遠不夠，尤其是在生物分子定量檢測和生物成像時，如何在實現優異水溶性的同時保留材料原有高的發光效率等。因此， 如何通過水相合成法或在油溶性CuInS2QDs表面有效進行功能化修飾以提高水溶性和生物相容性，最終制備出高熒光效率及發光覆蓋近紅外區域水溶性CuInS2QDs仍面臨著巨大的挑戰。