枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01抑菌效果與對番茄枯萎病防效的初步研究

張蕭蕭，張心青，楊傳倫，郭南南，車樹剛，冉新新，王秀芝，傅英旬

（黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500）

枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種土傳病害，可危害瓜類、豆類、茄果類等多種經濟作物。番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌［Fusarium oxysporum f.lycopersici（sacc）snyder et Hansen］引起的一種維管束病害。由于尖孢鐮刀菌不斷進化出新的生理小種，且其厚垣孢子能夠長期在土壤中存活，使得番茄枯萎病的防治十分困難［1］。番茄是我國的主栽蔬菜之一，由于設施番茄連續種植，由枯萎病菌引起的土傳病害連作障礙日趨嚴重，發病危害嚴重的大棚減產達30%～50%，已成為設施番茄安全生產的主要瓶頸［2］，嚴重影響番茄生產和品質。

目前生產上番茄枯萎病的防治主要有農業防治、化學防治與生物防治。采用高溫悶棚等農業防治效果一直不理想，連作障礙發生依然嚴重；而大劑量化學農藥處理易造成環境污染、農藥殘留等，嚴重危害人類健康與環境［3，4］。在農業供給側結構性改革的大背景下，對環境干擾小、符合可持續發展理念和國家綠色興農方針的生物防治成為研究熱點。其中拮抗細菌作為土壤中的優勢菌種，因其培養方便、生產周期短等優勢應用最廣，目前應用于番茄枯萎病防治的生防菌包括真菌、細菌、放線菌［5，6］，其中研究最熱的細菌主要為芽孢桿菌（Bacillus spp.）和假單胞菌（Pesudomonas spp.）等［7－10］。雖然具有防病促生功能的生防細菌較多，但是具有廣譜抗性和強適應力的菌種較少，通過篩選或改造獲得抗菌活性高、抑菌譜廣的菌種，成為生物防治番茄枯萎病的首要任務［11］。

本研究室前期已通過篩選與ARTP誘變，獲得1株枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01，初步試驗表明該突變株對番茄枯萎病菌具有較強的拮抗性與良好的遺傳穩定性，盆栽試驗防效達到75.76%［12］，本研究進一步測定了該菌株對其他作物枯萎病的抑制率和對番茄枯萎病的田間防治效果，以期為其商業化應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01是本實驗室從連作番茄土壤中分離并經ARTP誘變篩選獲得；作物枯萎病病原真菌包括番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、甜葉菊枯萎病菌、花椰菜枯萎病菌，26種真菌性病原菌（辣椒疫霉病菌、土豆立枯絲核病菌、棉花紅腐病菌、水稻紋枯病菌、豇豆黑斑病菌、黃瓜紅粉病菌、玉米小斑病菌、草莓褐斑病菌、草莓根腐病菌、小麥赤霉病菌、膠孢炭疽病菌、大豆鏈格孢病菌、核盤菌、蘋果腐爛病菌、白菜炭疽病菌、湖南煙疫病菌、黃瓜黑星病菌、層生鐮刀菌、黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌、花椰菜黑斑病菌、灰葡萄孢菌、小麥根腐病菌、黃瓜靶斑病菌、番茄葉霉病菌和番茄灰葉斑病菌）和3種細菌性病原菌（番茄青枯病菌、黃瓜角斑病菌、姜瘟病菌）均由本實驗室保存。田間小區防效試驗于2019年8—10月在博興縣店子鎮試驗大棚進行，供試品種為紅粉。

1.1.2 培養基 （1）LB培養基：氯化鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體加入1.8%～2.0%的瓊脂粉，121℃滅菌20 min。（2）PDA培養基：取200 g土豆去皮切塊，于800～900 mL蒸餾水中煮30～40 min，冷卻后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，攪拌至完全溶解后定容至1 000mL，固體加入1.8%～2.0%的瓊脂粉，121℃滅菌20 min。（3）發酵培養基：葡萄糖10 g，酵母膏3 g，K2HPO4·3H2O 2 g，MgSO40.25 g，豆粕20 g，氯化鈉10 g，pH＝7.5，用蒸餾水混勻并定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要設備 XSP－BM 系列生物顯微鏡，購自上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；SHP－150智能生化培養箱，購自上海博迅實業股份有限公司；SW－CJ－2F超凈工作臺，購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司；恒溫振蕩器，購于上海旻泉儀器有限公司；TG－16WS臺式高速離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變株YJY19－01活化與培養 將枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01于固體LB平板進行活化，挑取單菌落接入含有100 mL LB液體培養基中，置于37℃、170 r／min搖床中培養14～16 h，制成種子液。以1%的接種量將種子液接種于發酵培養基中培養24 h，調節發酵液中枯草芽孢桿菌濃度至（1×109～1×1010）cfu／mL。

1.2.2 突變株YJY19－01對8種作物枯萎病病原真菌的抑制作用 采用平板對峙法：將8種作物枯萎病菌分別接種到PDA培養基平板上活化，待真菌長滿平板后用滅菌打孔器從菌落外緣均勻打出直徑為8 mm的圓形菌塊。將菌塊接種在新的PDA平板中心，在其四周距中心25 mm等距離處接種突變株YJY19－01，對照組直接接種病原真菌菌餅，每處理3個重復，28℃恒溫培養，待對照組病原菌長滿平板時，采用十字交叉法［7，13］測定菌落直徑并計算抑制率。

抑制率（%）＝（對照病原菌直徑－處理病原菌直徑）／對照病原菌直徑×100。

1.2.3 突變株YJY19－01對其他病原菌的抑制作用 對真菌病原菌的抑制作用采用平板對峙法測定。真菌病原菌菌落為圓形或能覆蓋YJY19－01菌，表示沒有拮抗作用；菌落變形，如方形、菱形、花瓣形等，則視為具有拮抗作用。對細菌病原菌的抑制作用采用改良后的抑菌圈法［7］：在LB培養基上接種細菌病原菌進行活化，然后挑取單菌落接種至50 mL LB液體培養基中，于37℃、170 r／min振蕩培養2 d，用無菌水稀釋至108cfu／mL，在LB平板打孔加入50μL YJY19－01發酵液，并用病原細菌稀釋液噴霧，37℃培養過夜，觀察有無抑菌圈。若出現抑菌圈，則視為具有拮抗作用，若未出現抑菌圈，則表示沒有拮抗作用。

1.2.4 田間小區防效試驗［14，15］選擇番茄枯萎病發生嚴重且連作3年以上的田塊。共設3個處理：突變株YJY19－01菌劑組、50%多菌靈500倍稀釋液藥劑組和清水對照組。每個處理3次重復，共9個小區，每個小區面積為20 m2，隨機排列。在番茄6～7片真葉時進行移栽，移栽時采用孢子懸浮液灌根法接種番茄枯萎病病菌。移栽10 d后進行第一次灌根處理，每棵苗300 mL，間隔15 d再灌根1次，共防治2次。30 d后調查番茄植株枯萎病發病情況，計算防效。

番茄枯萎病病情分級標準：0級，無癥狀；1級，1～2片真葉變黃或真葉萎焉下垂；2級，3～4片真葉變黃或萎焉下垂；3級，5～6片真葉變黃或真葉萎焉下垂；4級，全株嚴重萎焉，以致枯死。

發病率（%）＝處理發病株數／處理總株數×100；

病情指數＝∑（各級病株數×各級代表值）／（調查總株數×最高級代表值）×100；

防治效果（%）＝（對照區病情指數－試驗區病情指數）／對照區病情指數×100。

2 結果與分析

2.1 突變株YJY19－01對8種作物枯萎病病原真菌的抑制作用

由圖1、表1可以看出，枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01對8種作物枯萎病菌均有明顯抑制作用，抑制率在75.06%～80.12%之間。

圖1 突變株YJY19－01對8種作物枯萎病病原真菌的平板對峙結果

表1 突變株YJY19－01對8種作物枯萎病病原真菌的抑制率

2.2 突變株YJY19－01對其他常見作物病原菌的抑制作用

抑制作用結果（表2）表明，突變株YJY19－01除對8種作物枯萎病菌有抑制效果外，對其他26種作物真菌性病原菌和2株細菌性病原菌均有明顯抑制效果，僅對姜瘟病菌無抑制效果。

表2 突變株YJY19－01對29種常見作物病原菌的抑制效果

2.3 田間防效試驗

由表3可知，對照、藥劑組和菌劑組的發病率分別為93.33%、26.67%和18.33%，病情指數分別為54.30、18.88和13.34，藥劑組和菌劑組的防效分別為65.23%和75.43%，表明枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01對番茄枯萎病的防效高于常規藥劑50%多菌靈500倍稀釋液。

表3 突變株YJY19－01對番茄枯萎病的田間防效

3 討論與結論

博興縣店子鎮有“中國優質西紅柿之鄉”的美稱，由于番茄連年栽種導致其枯萎病等土傳病害日漸加重，嚴重影響了番茄產量與品質。由于我國農業耕地現狀、安全、環保政策等原因，生物防治得到了迅速發展，其中芽孢桿菌，特別是枯草芽孢桿菌，因為具有安全性和能產生抗菌物質等特性，被廣泛用來防治植物病害［16］。但是生物防治也存在一些不足，如田間防治效果不穩定、藥效作用緩慢、抑菌譜較窄［17］等。枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01是本實驗室前期通過篩選并經ARTP誘變獲得，具有良好的遺傳穩定性。本研究結果表明，突變株YJY19－01具有廣譜抑菌性，除對8種作物枯萎病菌有較高的抑制效果外，還對其他26種真菌性病原菌和2種細菌性病原菌具有明顯抑制效果；另外田間試驗結果表明突變株YJY19－01對番茄枯萎病的田間防效在75%以上，與前期盆栽防效一致，進一步表明突變株YJY19－01是一株對番茄枯萎病具有穩定拮抗效果的生防菌，也是一株針對多種作物病害具有潛在防效的生防菌。

芽孢桿菌防治植物枯萎病的作用機制主要包含4個方面，即競爭、拮抗、誘導作物的抗病性和促進作物生長［18］。大量研究結果表明芽孢桿菌能分泌多種抗菌物質，包括抗生素、脂肽、抗菌蛋白等，從而抑制植物病菌的生長［19－22］。胡陳云等［23］研究發現枯草芽孢桿菌ge25產生的fengycin類脂肽（含C-16 fengycin A和C-15～C-18 fengycin B同系物或衍生物）會顯著抑制人參黑斑菌和銹腐菌的正常生長，破壞病原菌的菌絲結構，改變菌絲細胞膜通透性。枯草芽孢桿菌突變株YJY19－01的抑菌機理還有待進一步研究。

由于生物防治存在的一些不足［18，19］，其還不能完全取代化學藥物，枯萎病等土傳病害的治理在努力采用新技術的同時，也要注意各單項防治技術的互相配合，近年來發展形成的生物與化學相結合的策略［24－27］，既能有效控制病害，又能降低化學農藥使用量，但是高濃度的化學藥劑對拮抗細菌生長一般都有抑制作用，因此突變株YJY19－01與常用低毒化學藥劑的相容性也需要進一步研究，為運用生物防治和高效低毒農藥的綜合防治提供依據。