煙草環斑病毒RT－PCR檢測體系的優化

郇曉雪，劉曉宇*，房樂，杜傳印，李廣強，耿超，李向東，田延平

（1.山東農業大學植物保護學院，山東 泰安 271018；2.山東濰坊煙草公司，山東 濰坊 261061；3.棗莊市農業農村事業發展中心，山東 棗莊 277899）

煙草環斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）是豇豆花葉病毒科（Comoviridae）線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）代表種［1，2］，1927年首次發現于美國。目前TRSV已在50多個國家發生，是我國公布的二類進境檢疫有害生物［3］。其粒子為球形，基因組含兩條線形正義ssRNA，其中RNA1編碼復制酶，RNA2編碼運動蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）［4，5］。

TRSV寄主范圍廣泛，能夠侵染大豆（Glycine max）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）以及煙草（Nicotiana tabacum）等54科300多種植物［6－9］，可通過種子、嫁接以及介體傳播。TRSV的傳播介體包括美洲劍線蟲（Xiphinema americanum）［10－12］、煙薊馬（Thrips tabaci）、煙草跳甲（Epitrix hirtipennis）、蚜蟲（Myzus persicae）等［13－15］。張滿良等［16］報道了TRSV在渭北地區煙草上的危害，證明該病毒可通過蚜蟲和種子傳播，但不同煙草品種的種子帶毒率有差異。種子和無性繁殖材料是TRSV遠距離傳播的重要方式［17］。2003—2008年我國2次在進口大豆中檢測到TRSV［18］。2007年聞偉剛等［19］從美國進口大豆中檢測到TRSV。2009、2010年文朝慧等［20，21］分別在荷蘭蘿卜種子和番茄種子中檢測到TRSV。

TRSV的準確檢測是對檢疫工作的一項挑戰。血清學方法和RT－PCR方法是鑒定該病毒的重要手段［22］。但血清學檢測存在一定的不足，雖然絕大多數TRSV分離物具有相同的血清學關系，但發現至少存在4種具有不同血清學關系的株系，而且TRSV與該屬亞組的馬鈴薯黑環斑病毒存在血清學相關性［14］。IC－RT－PCR結合了血清學和RT－PCR技術優點，但血清學上的交叉反應和潛在的錯檢漏檢也給TRSV準確檢測帶來隱患。李桂芬等［23］研制的DAS－ELISA試劑盒檢測純化病毒靈敏度為15.625 ng／mL。對種子等病毒含量低的植物材料，利用該方法可能存在漏檢情況。煙草種子可攜帶TRSV，但利用ELISA方法不能準確檢測出種子帶毒情況［16］。

RT－PCR是檢測植物病毒應用最為廣泛的方法之一，在新發病毒或無特異性抗體的病毒檢測中的作用尤為突出。楊翠云等［24］利用膠體金免疫層析試紙結合RT－PCR方法建立了TRSV檢測方法，靈敏度與DAS－ELISA類似。魏梅生等［25］建立了磁免疫層析試紙條方法檢測TRSV，檢測提純病毒靈敏度為1μg／mL。楊偉東［26，27］、鄭耘［28］等建立的基于RT－Realtime PCR、IC－RTRealtime PCR以及DB－RT－Realtime PCR檢測方法，靈敏度分別為0.5 ng、25 ng和2 500 ng葉組織。易汪雪等［29］建立了單管實時熒光RTPCR，可檢測到的大豆種子中的TRSV濃度為0.35 pg／mL。應淑敏、張吉紅［30，31］等利用LAMP檢測TRSV，靈敏度為普通RT－PCR的10倍。郭立新等［32］研究發現RT－LAMP檢測靈敏度與常規RT－PCR技術靈敏度相當。以上表明引物的特異性、擴增條件等因素影響擴增結果的準確性和靈敏度。

建立高靈敏度和特異性的檢測體系是防控TRSV的重要保障。該技術在新冠病毒核酸檢測篩選新冠病毒陽性患者過程中起了舉足輕重的作用［33］。本研究對引物特異性、退火溫度及dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶濃度等條件進行優化，以期建立針對TRSV的RT－PCR檢測體系，為準確、靈敏檢測TRSV提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為攜帶煙草環斑病毒的普通煙株，在溫室中培養。溫度為22℃，光照16 h，黑暗8 h。

1.2 RT－PCR引物設計

NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）上獲取目前已知的全部煙草環斑病毒共20個全基因組序列（截至2021年1月17日），利用DNAMAN軟件進行序列分析，獲得煙草環斑病毒基因組中保守區域，在序列保守區域內利用軟件Primer Premier 6.0設計特異性引物［34］（表1）。

表1 本研究所用引物

1.3 植物總RNA提取和反轉錄

將新鮮或超低溫保存的攜帶煙草環斑病毒的煙草葉片樣品迅速轉移至液氮預冷的研缽內，充分研磨后轉移至預冷的2.0 mL離心管中，加入1.0 mL TransZol（TransGen Biotech），具體提取步驟參考TransZol說明書。提取的RNA 保存－80℃備用。

利用Scandrop儀器測定RNA濃度：取500 ng植物總RNA，移至RNase free PCR管中，加入50 ng隨機引物，加水至10μL，70℃條件下變性10 min后迅速在冰上靜置2 min。在上述PCR管中加入4μL 5×M－MLV Buffer（TaKaRa），1μL 10 mmol／L dNTPs，0.5μL RNase Inhibitor（TaKa-Ra），0.5μL RTase M－MLV，4μL RNase free ddH2O。30℃預處理10 min后，42℃反應1 h，75℃10 min終止反應，獲得的cDNA用于后期PCR擴增。

1.4 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

PCR擴增體系：10×PCR Buffer 2.0μL、dNTPs（2.5 mmol／L）1.0μL、F引物0.5μL、R引物0.5μL、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）0.3μL、模板cDNA 1.0μL，ddH2O補齊到20μL。PCR程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參考表1），72℃延伸40 s，30個循環；72℃延伸7 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳（120 V 30 min），溴化乙錠（EB）染色，凝膠成像系統觀測電泳結果并拍照保存。

1.5 擴增條件優化和靈敏度檢測

為了獲得最佳的擴增效果，依次對退火溫度和dNTPs、引物以及Taq DNA聚合酶最佳工作濃度進行優化。退火溫度設置成8個梯度：45、46、48、51、53、55、58、60℃；在獲得最佳退火溫度的基礎上，對dNTPs工作濃度進行優化，設置10個dNTPs濃度梯度：0.010、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225 mmol／L；進一步將引物終濃度設置成7個梯度：0.03、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50μmol／L；在以上優化的PCR條件基礎上，將Taq DNA聚合酶終濃度設置成10個梯度：0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055 U／μL，最終獲得最優的擴增條件。

在靈敏度試驗過程中，利用超微量分光光度計（Scandrop）測定提取的病葉總RNA濃度，分別取1 200.00、300.00、90.00、30.00、9.00、3.00、0.90、0.30、0.09 ng和0.03 ng植物總RNA進行反轉錄，反轉錄總體系為10μL。利用優化后的條件進行靈敏度檢測。

2 結果與分析

2.1 特異性引物的篩選

針對TRSV基因組的保守區域，設計6對特異性引物，以感病植株cDNA為模板分別進行PCR擴增。結果表明，6對特異性引物都能從感染TRSV的病株中擴增出特異性目的條帶，不同引物對的擴增結果差異明顯（圖1）。1－1F／1－1R引物末端保守性高，且GC含量相對較低，非特異性結合少，所以選擇擴增結果相對較好的1－1F／1－1R進行后續試驗。

2.2 RT－PCR檢測體系建立和優化

對退火溫度進行優化的結果（圖2A）表明，在設定的溫度范圍內，引物對1－1F／1－1R均能擴增出特異性目的條帶，表明引物具有較好的特異性，退火溫度對擴增影響不大，后續研究選擇53℃。

對dNTPs濃度進行優化的結果（圖2B）表明，不同dNTPs濃度下均能擴增出特異性目的條帶，但在大于0.075 mmol／L時，擴增效果最佳。

對引物終濃度進行優化的結果（圖2C）表明，當引物終濃度小于0.20μmol／L或大于0.30 μmol／L時出現微弱的非特異性條帶，引物終濃度為0.30μmol／L時擴增效果最佳。

對Taq DNA聚合酶終濃度進行優化的結果（圖2D）表明，當Taq DNA聚合酶終濃度大于0.035 U／μL時，均具有較好的擴增效果。

圖2 RT－PCR檢測體系的建立和優化

根據篩選獲得的條件，最終將擴增條件確定為退火溫度53℃、dNTPs終濃度為0.075mmol／L、引物終濃度為0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶終濃度為0.035 U／μL。

2.3 RT－PCR檢測體系靈敏度測定

分別取反轉錄產物1.0μL（起始植物總RNA量的1／10）進行PCR擴增。結果表明，當TRSV病毒RNA總量大于等于0.090 ng時，引物對1－1F／1－1R可檢測出TRSV（圖3）。

圖3 TRSV RT－PCR檢測體系靈敏度測定

3 討論與結論

本研究設計了不同特異性引物對，并優化了TRSV的RT－PCR檢測體系。結果表明，針對TRSV基因組RNA1設計的特異性引物對1－1F／1－1R擴增效果最佳。在退火溫度53℃、dNTPs終濃度0.075 mmol／L、引物終濃度0.30μmol／L、Taq DNA聚合酶終濃度0.035 U／μL時擴增效果最佳。感病植物總RNA量為0.090 ng時仍可檢測到TRSV，表明優化后的檢測體系具有較高的靈敏度。

通過對反應體系中引物、擴增條件等的優化，可以顯著提高檢測的靈敏度。閆志勇等［35］構建的RT－PCR體系能夠從50 ng植物葉片（0.05 ng病毒RNA）中成功擴增到目的片段。本研究建立的檢測體系能夠從0.090 ng植物總RNA中檢測到TRSV目的片段，具有很好的靈敏度和特異性。研究結果對準確靈敏地檢測TRSV和切斷病毒傳播途徑具有重要意義。