氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶配伍后的體外抗菌作用研究

蔣公建，魏世軍，駱世軍，雷元軍，范建彪，艾笑揚，符華林*

（1.重慶市萬州區(qū)畜牧技術推廣站，重慶 萬州 404100；2.重慶市開州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 開州 405400；3.重慶先鋒動物藥業(yè)有限公司，重慶 萬州 404100；4.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術研究中心，四川 成都 611130）

氟苯尼考是動物專用的抗生素，在獸醫(yī)臨床中應用較廣泛［1］，但隨著細菌耐藥性的不斷出現(xiàn)，氟苯尼考須大劑量使用才能在臨床上達到良好的治療效果，這無疑增加了該藥的應用成本［2］。磺胺間甲氧嘧啶屬于磺胺類的代表藥物之一，在體內和體外均有較強的抗菌作用，細菌雖會對此藥產生耐藥性，但速度較慢。本試驗旨在探討氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥的體外抑菌效果，判斷它們在配伍后是否具有協(xié)同或相加作用，為氟苯尼考復方制劑的研制及其與磺胺間甲氧嘧啶臨床合理配伍提供科學依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 藥品與試劑 氟苯尼考，含量99.8%，湖北中牧宏達藥業(yè)有限公司生產，批號：20 180814；磺胺間甲氧嘧啶，含量99.5%，安徽華澳生物技術有限公司生產，批號：20170321。MH 液體培養(yǎng)基、MH瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗菌株 大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，由四川農業(yè)大學藥物安全性評價研究室提供，系臨床分離致病菌。

2 試驗方法

2.1 細菌的培養(yǎng) 從新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌平板上分別挑取2～3 個菌落，每種細菌分別單獨接種到2 mL MH肉湯試管中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h后，用計數(shù)法分別測定三種菌液的濃度。用生理鹽水稀釋菌液至3.0×108CFU/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 抗菌藥物的制備 用分析天平分別稱取氟苯尼考和磺胺間甲氧嘧啶適量，氟苯尼考以純化水超聲溶解并配成100 μg/mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾，置4 ℃冰箱保存。磺胺間甲氧嘧啶用NaOH 液溶解，以純化水定容至6.4 mg/mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾后，置4 ℃冰箱保存［4］。

2.3 抑菌活性的測定 參照美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）藥敏試驗標準，采取微量肉湯法測定每種藥物對三種細菌的MIC值［5］。將試驗需要的所有器材放入超凈工作臺用紫外燈照射30 min，將藥液用MH 肉湯二倍稀釋后加入96 孔板第一排的第1～11 孔，每孔加入經(jīng)梯度稀釋的不同濃度藥液100 μL，MH肉湯90 μL，菌液10 μL（使得每孔細菌終濃度為1×105～2×105CFU/mL），第12 孔作為陽性對照。前三排為對照重復樣本。第四排作為藥物陰性對照，只加入對應藥液濃度的藥液100 μL，MH 肉湯90 μL，生理鹽水10 μL。第五排作為培養(yǎng)基陰性對照，每孔加入生理鹽水110 μL，MH 肉湯90 μL。將加好試液的96孔板放置于漩渦震蕩儀上，混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，然后觀察結果［6］。肉眼觀察96 孔板每一行中渾濁孔前的澄清孔的藥液終濃度，以此作為MIC 值。按此方法測定兩種藥物對三種細菌的抑菌活性。完全按照上述程序進行重復試驗1 次，當MIC 值能準確重復或差1 個濃度梯度時，試驗結果即為有效。

2.4 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合應用的藥敏試驗 采用肉湯稀釋棋盤法［7］測定氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶體外聯(lián)用的抗菌活性。將已經(jīng)測定好MIC 值的氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶組合，在96 孔板的A～F 行沿橫軸方向（從左往右）依次加入終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC的氟苯尼考藥液50 μL，以同樣的方法在第1～6 列沿豎軸方向（從上到下）依次加入終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC的磺胺間甲氧嘧啶藥液50 μL，然后每孔加入MH肉湯90 μL，菌液10 μL（使得每孔終濃度為1×105～2×105CFU/mL）。第七排的第1、2、3 孔只加入MH 肉湯100 μL，第八排的第1、2、3孔只加入生理鹽水100 μL。將加好試液的96孔板放置于漩渦震蕩儀上，混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，然后觀察結果并計算澄清孔的FIC值。完全按上述程序重復3次。

2.5 聯(lián)合效應評價標準 試驗結果以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗的判斷依據(jù)［8］：

當FIC指數(shù)≤0.5時，判斷二者為協(xié)同作用；當0.5＜FIC 指數(shù)≤1 時，判斷二者為相加作用；當1＜FIC 指數(shù)≤2 時，判斷二者為無關作用；當FIC指數(shù)＞2時，判斷二者為拮抗作用。

3 結果與分析

3.1 藥物單用時的MIC 測定結果 氟苯尼考單用對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均為5 μg/mL，結果與吳碩文等［7］的研究結果相符。磺胺間甲氧嘧啶單用對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的MIC 均為160 μg/mL，該結果與郭永剛等［9］的研究結果相符。

3.2 聯(lián)合用藥的測定結果 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對三種細菌的FIC值測定結果如表1～表3所示。由表可知，氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶配伍使用對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的MIC均有所下降，表明二者聯(lián)用后抗菌活性有所加強。

表1 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對大腸桿菌FIC值的測定

表2 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對沙門氏菌FIC值的測定

表3 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌FIC值的測定

兩藥單用與聯(lián)合應用的抑菌效果如表4 所示。磺胺間甲氧嘧啶與氟苯尼考聯(lián)用時，磺胺間甲氧嘧啶的MIC 比單用時減少到1/32～1/2，氟苯尼考的MIC 比單用時減少了1/2。說明二者配伍使用可有效降低藥物的使用量，二者聯(lián)合用藥對三株細菌的部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)大于0.5且≤1，可見二者聯(lián)用表現(xiàn)為相加作用。

表4 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶單用及聯(lián)合應用對三種菌的抑菌結果

4 分析討論

4.1 聯(lián)合用藥的抗菌機理分析 氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶分別對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑制作用。二者聯(lián)用產生相加作用可能是因為氟苯尼考與磺胺間甲氧嘧啶的作用靶點不同所致，其作用機理可能為：氟苯尼考抑制細菌蛋白質的合成，而磺胺間甲氧嘧啶可以抑制細菌DNA的合成，如果將兩者以適當比例配伍則可從兩方面抑制細菌生長，增強其抗菌效果。

4.2 聯(lián)合用藥的合理性討論 聯(lián)合用藥可以打破不同藥物藥效作用不足帶來的限制，充分發(fā)揮協(xié)同作用，減少藥物的用量，從而有效地控制成本。藥物在聯(lián)合使用時會互相影響而使療效及不良反應發(fā)生變化。合理的聯(lián)合用藥能增強療效，減少不良反應，避免或延緩耐藥性產生，延長療程，這是控制抗生素大量使用的重要方法。

本試驗雖從體外抗菌效應的角度驗證了兩者可組方使用，但未就其配伍穩(wěn)定性、體內毒性等方面進行驗證，還需待進一步探究。