焦化廠PAHs污染土壤中微生物群落多樣性特征

王荔，張騰飛，楊蘇才?，劉志號，茍雅玲，趙倩云，孫仲平，喬鵬煒

1.工業場地污染與修復北京重點實驗室,輕工業環境保護研究所

2.煜環環境科技有限公司

多環芳烴(PAHs)具有致癌、致畸、致突變和生物積累、放大等特征,是焦化廠、加油站、儲油庫等場地中常見的一類持久性有機污染物[1-2],已被美國國家環境保護局(US EPA)列入優先控制污染物名錄[3]。土壤環境中PAHs污染來源較廣,焦化廠中含PAHs的石油類化合物的遺撒或滲泄漏是重要來源之一[4]。目前已開發出多種有機污染土壤的修復技術,微生物修復技術因其安全、經濟、環保等優勢,被認為是很有潛力的原位修復技術[5-6]。

受PAHs污染的土壤,其微生物群落組成往往會發生變化[7]:一方面,微生物對有機污染物適應性的遺傳機制表明,污染環境中的微生物可以進行選擇性富集,逐漸形成能夠降解有機污染物的優勢菌群；另一方面,優勢菌群利用包氣帶土壤中的PAHs作為微生物可利用碳源或形成共代謝[8]。因此,研究焦化廠土壤中微生物群落結構特征及其影響因素,對PAHs污染土壤微生物修復技術的研發具有重要指導意義[9-11]。

目前,有關石油類污染土壤的微生物學研究大多集中于污染土壤的細菌群落結構解析或PAHs降解菌篩選方面[12-13],對微生物群落結構影響因素的探究較少,但土壤的理化性質及污染物濃度是影響土壤微生物功能多樣性的關鍵因素[14]。因此,筆者以華北某焦化廠為研究對象,隨機選取30個土壤樣品(0~10 m深度)進行PCR熒光定量和高通量測序,使用統計方法分析土壤中細菌豐度、群落結構與土壤理化指標之間的關系,旨在為焦化廠土壤修復技術研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與保存

所選華北某焦化廠建于20世紀70年代,占地面積約20 hm2,2018年11月停產搬遷。選擇5個采樣點(記為A、B、C、D、E)進行土壤樣品采集,每個點采樣深度分別為 －0.5~0、－2.5~－2.0、－4.5~－4.0、－6.5~－6.0、－8.5~－8.0、－10.5~－10.0 m,用編號1~6表示。采集的土壤樣品用無菌袋密封好,放在含有冰袋的樣品保存箱中,迅速送回實驗室,過2 mm篩后儲存于－20℃環境中以備后續分析測試。

1.2 土壤理化性質及PAH濃度測定

土壤PAHs濃度依據文獻[15]測定:取2 g干燥土壤樣品放入40 mL聚四氟乙烯離心管中,分別加入正己烷和二氯甲烷各15 mL,超聲30 min,高速離心10 min,此過程重復3次。離心所得液體經無水硫酸鈉過濾后經旋轉蒸發儀和氮吹儀濃縮,用二氯甲烷定容至1 mL,然后取200μg液體加入內標物待測。檢測儀器為氣相色譜-質譜聯用儀(GC∕MS),色譜柱為HP-5MS。測定條件:進樣口溫度為290℃,設置分流進樣,分流比為2∶1,進樣量為1.0 μL；升溫程序為起始溫度40℃,保持2 min,以10℃∕min升至240℃,保持3 min,再以5℃∕min升至320℃,保持10 min；質譜為EI電子源,選擇Scan模式。土壤pH采用2.5∶1.0的水土比,用pH儀(PHS-3C型)測定,含水率采用烘干法測定[16]；土壤總有機碳(TOC)濃度采用TOC分析儀(Elementar,德國)測定,全氮、速效鉀、有效磷濃度分別采用凱氏定氮法、火焰光度法及Olsen法測定[17]。

1.3 土壤微生物DNA提取及微生物指標分析

根據土壤DNA提取試劑盒(DNeasy Power Soil Kit)的使用說明,從0.5 g土壤樣品中提取微生物總DNA。微生物高通量測序分析委托北京賽奧吉諾生物科技有限公司進行。利用實時熒光定量PCR,檢測細菌的基因拷貝數(N),PCR擴增條件參照Gou等[17]方法進行,細菌數量以lgN計。16S rDNA基因的擴增引物為1369F(5′-CGGTGAATACGTTCYCGG)∕1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT),探針為TM1389F(CTTGTACACACCGCCCGTC)。借助Illumina MiSeq v3測序平臺研究土壤微生物群落組成,并在門水平上分析與比較污染土壤中細菌群落組成的變化。

1.4 數據處理

使用Excel和SPSS 19.0軟件進行相關數據的統計分析,采用CANOCO 4.5軟件中的冗余分析(redundancy analysis,RDA)確定環境因子對土壤微生物群落組成的影響。

2 結果與討論

2.1 土壤樣品理化性質

30個土壤樣品的理化性質如表1所示。由表1可知,土壤pH、含水率與有機質、有效磷、全氮和速效鉀濃度在各土壤樣品間存在顯著差異。其中,土壤pH為7.22~8.65；TOC濃度為0.61%~4.71%,平均值為1.05%；含水率為0.90%~22.29%,平均值為14.00%；有效磷濃度為0.9~13.4 mg∕kg,平均值為6.9 mg∕kg；全氮濃度為0.12~0.93 g∕kg,平均值為0.47 g∕kg；速效鉀濃度為4.18~266.00 mg∕kg,平均值為98.95 mg∕kg。

表1 土壤樣品理化性質Table 1 Physicochemical properties of soil samples

土壤樣品中PAHs濃度如表2所示。由表2可知,A、E采樣點為輕污染區,PAHs濃度為2.05~38.12 mg∕kg；B、D采樣點為中污染區,PAHs濃度為2.36~173.64 mg∕kg；C采樣點為重污染區,PAHs濃度為2.81~1 256.21 mg∕kg。 整體而言,土壤中PAHs濃度隨采樣深度增加而降低。土壤中2~3環PAHs在不同采樣點占比為9.84%~64.80%,4環PAHs占比為12.06%~56.34%,5~6環PAHs占比為21.34%~73.91%。相對于2~3環PAHs,土壤中4環以上PAHs污染較重?？赡苁且驗榈头肿恿康腜AHs易揮發降解,不易積累；高分子量PAHs蒸氣壓高且生物有效性低,在土壤中積累較多[18]。

表2 土壤樣品中PAHs濃度Table 2 PAHs concentrations in soil samples mg∕kg

2.2 土壤中細菌豐度

土壤環境中微生物豐度可反映土著細菌數量的變化規律[19]。5個采樣點各分層土壤樣品的細菌豐度如圖1所示。由圖1可知,不同采樣點細菌豐度差異較大,輕污染區A、E采樣點土壤細菌數量的lgN分別為5.33~7.31和6.60~7.92；中污染區B和D采樣點的lgN分別為7.10~7.75和5.48~8.89；高污染區C采樣點的lgN為6.63~8.25。

圖1 土壤樣品中細菌豐度Fig.1 Microbial abundance in soil samples

研究[20]表明,土壤中細菌豐度與土壤環境因子相關性越大,表明微生物對環境變化越敏感。土壤中細菌豐度與土壤各環境因子相關系數如表3所示。由表3可知,土壤中細菌豐度與采樣深度呈負相關(R2＝－0.739,P<0.01)。Ekelund等[21]的研究表明,表層土壤細菌豐度遠高于深層土壤,且隨著采樣深度增加,細菌豐度隨之降低；Taylor等[22]對美國艾奧瓦州和密歇根州的土壤進行表層—中層—深層剖面微生物量分析,發現微生物量隨土壤深度增加而顯著減少,上述研究與本研究結論一致。本研究中TOC、全氮濃度與細菌豐度呈明顯正相關(R2分別為0.403和0.405,P<0.05),不少學者在其他土壤剖面中觀察到相似的細菌豐度變化趨勢,認為較高的TOC和氮濃度有助于增加土壤微生物量[23-25]。

土壤細菌豐度與PAHs、不同環數PAHs濃度的相關性分析結果表明,細菌豐度與PAHs濃度相關性不顯著。排除PAHs濃度異常偏高的C2和C3樣品(PAHs濃度分別為1 256.21和925.47 mg∕kg)后,土壤中細菌豐度與PAHs濃度(R2為0.463,P<0.05)、不同環數PAHs濃度均呈正相關(表3)。這可能是因為PAHs雖為降解菌提供可利用生長基質,但微生物對有機污染物的耐受性存在閾值,超過閾值的高濃度PAHs有明顯生物毒性[26-28]。土壤中微生物數量與烴類化合物污染程度存在密切關系,一定濃度的PAHs污染可以刺激優勢菌群的生長,但當PAHs污染程度較重時,則對微生物產生抑制作用[29]。

表3 細菌豐度與土壤各環境因子相關系數Table 3 Correlation coefficients between bacterial abundance and soil environmental factors

2.3 土壤微生物群落多樣性

不同采樣點土壤中細菌類群門水平的相對豐度如圖2所示。由圖2可知,各采樣點土壤微生物群落結構和分布有顯著差異。通過門水平下細菌群落組成的比較,能夠初步明確土壤樣品的優勢門類群[30]。變形菌門(Proteobacteria)在土壤樣品中占有絕對優勢地位,其次是綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和酸桿菌門(Acidobacteria),這5個門細菌數量占門水平分類微生物數量的64%~97%。Sutton等[7]發現Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi是烴類污染土壤的主要細菌類群。報道稱在有氧或缺氧條件下,參與PAHs代謝和遺傳調控的降解菌大多屬于這5個門[14,31-32]。值得一提的是,該焦化廠土壤中Proteobacteria相對豐度占比最高達90%,這可能是因為土壤被PAHs污染后,微生物之間發生水平基因轉移或在微生物染色體內進行基因重排、突變、復制,由此馴化得到能夠降解PAHs的優勢細菌[8]。假單胞菌(Pseudomonas)和鞘氨醇單胞菌(Sphingomonads)已被證實是芳香烴的優勢降解細菌,可利用脂肪烴類或稠環芳烴類作為唯一碳源和能量來源去除PAHs[33]。Bell等[34]研究表明,Proteobacteria是石油污染土壤的主導微生物,直接參與烴類物質降解。Gou等[35]研究表明,受PAHs污染嚴重的土壤中,降解PAHs的主要細菌群體為Proteobacteria。此外,Proteobacteria多為化能異養型,具有較高氮素轉化和利用能力,通過添加硝酸鹽電子受體可刺激該類微生物的生長[36],為有機污染場地微生物修復提供必備條件。

圖2 土壤樣品中不同細菌類群門水平的相對豐度Fig.2 Relative abundance at phylum level of different bacterial groups in soil samples

2.4 優勢細菌類群與環境因子冗余分析

基于土壤細菌類群(門)OTU聚類結果與環境變量進行冗余分析[37],結果如圖3所示。由圖3可知,該焦化廠土壤環境因子共解釋細菌群落變異的33.59%,其中第1主軸(RDA1)和第2主軸(RDA2)分別解釋18.31%和15.28%。環境因子與樣本相關程度大小依次為pH>K(速效鉀)>HIGH(4~6環PAHs)>PAHs>N(全氮)>LOW(2~3環PAHs)>SWC(含水率)>DEPTH(采樣深度)>TOC>P(有效磷)?？梢?pH與速效鉀、PAHs和全氮濃度是影響采樣區土壤細菌群落組成的主要驅動因子。Proteobacteria、Bacteroidetes豐度與PAHs、2~3環PAHs、4~6環PAHs、全氮、速效鉀、有效磷、TOC濃度呈正相關；Chloroflexi、Acidobacteria豐度與pH、含水率呈正相關；Firmicutes和Actinobacteria豐度與采樣深度呈正相關。

圖3 環境因子與細菌群落組成關系的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of relationship between environmental factors and bacterial community composition

國內外有不少學者已關注到土壤理化性質和污染物濃度對不同細菌類群的形成有至關重要的作用[38-40]。土壤含水率、pH、有效磷、全氮、速效鉀是土壤微生境的基本組成,對細菌生存有顯著影響[41]。其中,pH是影響細菌群落結構的重要驅動因素[42]。本研究冗余分析表明,微生物群落結構受土壤pH影響明顯。此外,PAHs可為微生物提供可利用碳源和生長基質,也是影響土壤微生物群落結構的關鍵因素[43-44]。Proteobacteria、Bacteroidetes豐度與PAHs、2~3環PAHs、4~6環PAHs濃度呈正相關,表明這2個門細菌受PAHs濃度影響較大。Proteobacteria是PAHs的優勢降解菌[45],Zhang等[46]研究發現,有氧條件下,α-Proteobacteria和δ-Proteobacteria能有效降解菲；在缺氧條件下,降解菲的優勢菌主要為γ-Proteobacteria。β-Proteobacteria能在PAHs污染老化土壤中富集,并在有氧和缺氧環境下均顯示較強活性[43]。Proteobacteria作為本研究污染場地土壤的主導微生物,其相對豐度占全部細菌比例最高(達90%),可見,Proteobacteria可能在該焦化廠污染土壤PAHs降解代謝中起到不可忽視的作用。

3 結論

(1)焦化廠土壤樣品中細菌數量的lgN為5.33~8.89,其中,表層土壤細菌豐度遠高于深層土壤；土壤中細菌豐度與采樣深度呈明顯負相關,與土壤PAHs、TOC、全氮濃度呈明顯正相關。

(2)焦化廠土壤樣品中微生物的主要細菌類群(門)為 Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes和Acidobacteria,其占門水平分類細菌數量的64%~97%,其中PAHs優勢潛在降解菌Proteobacteria相對豐度占比最高達90%。

(3)焦化廠土壤細菌群落結構特征是PAHs污染和環境因子共同作用的結果,土壤pH與速效鉀、PAHs、全氮濃度是該焦化廠土壤細菌群落組成的主要驅動因子；PAHs優勢潛在降解菌Proteobacteria豐度受PAHs濃度影響較大,且呈正相關。