基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析補(bǔ)中益氣湯治療壓力性尿失禁的機(jī)制

鄭娛 翟新宇 王琛

摘要 目的：探討補(bǔ)中益氣湯治療壓力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）的分子作用機(jī)制。方法：運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索出補(bǔ)中益氣湯的藥物有效活性成分及其作用靶點(diǎn)。利用GeneGards、OMIM疾病數(shù)據(jù)庫篩選出該病靶點(diǎn)，借助Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建出補(bǔ)中益氣湯中藥的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，采用R軟件對靶基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的分析。結(jié)果：共得到補(bǔ)中益氣湯有效活性成分182個(gè)，通過116個(gè)潛在靶標(biāo)作用于SUI，富集得到GO中2 115個(gè)生物過程條目和144條KEGG通路。結(jié)論：補(bǔ)中益氣湯主要通過槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫寧、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇等活性成分調(diào)節(jié)SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、膀胱癌信號通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路、前列腺癌信號通路、胰腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路等多條通路來治療SUI。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);補(bǔ)中益氣湯;壓力性尿失禁;機(jī)制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of stress urinary incontinence（SUI）.Methods：Effective active ingredients and action targets of Buzhong Yiqi Decoction were retrieved with the aid of TCMSP while the disease targets were screened out using GeneGards and OMIM databases.The active ingredient of Buzhong Yiqi Decoction-target network and PPI network were established using Cytoscape 3.7.2 software.And then using R software the gene function of the target gene（Gene Ontology，GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway analysis were annotated.Results：A total of 182 effective active ingredients of Buzhong Yiqi Decoction were obtained，and 116 potential targets can act on SUI.GO functional enrichment analysis obtained 2 115 GO itemsin total.KEGG pathway enrichment analysis obtained 20 pathways.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction mainly through quercetin，kaempferol，7-methoxy-2-methyl isoflavone，7-O-methyl isoeugenol，riccocodone，β-sitosterol，formonine，medicinal pterostilbene，naringin，sugar alcohol and other active ingredients regulates key targets of SELE，ICAM1，MMP3，MAPK14，CD40LG，PLAU，CCNA2，ERBB3，CASP1，and regulates AGE-RAGE in diabetic complications Signal pathways，bladder cancer signaling pathways，fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathways，TNF signaling pathways，prostate cancer signaling pathways，pancreatic cancer signaling pathways，hepatitis B signaling pathways and other pathways so that SUI can be treated.

Keywords Network pharmacology; Buzhong Yiqi Decoction; Stress urinary incontinence; Mechanism

中圖分類號：R694+.54;R271.9;R285;TN711.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.007

女性尿失禁是目前全球最為常見的健康問題之一，隨著人口的老齡化和人們生活水平的提高，女性出現(xiàn)尿失禁的狀況越來越受到各方重視。近年流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果表示，成年女性的尿失禁發(fā)病率在18.5%～57.5%，而且隨年齡的增長而上升[1]。在所有類型的尿失禁當(dāng)中，壓力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）是最為常見的。國際尿控協(xié)會(huì)（International Continence Society，ICS）將SUI定義為：當(dāng)腹部壓力突然增加，例如運(yùn)動(dòng)，打噴嚏或咳嗽時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)不自主的尿液溢出[2]。SUI常見于年老體弱、妊娠分娩損傷、絕經(jīng)、肥胖等女性患者。國內(nèi)尿失禁發(fā)病率約30%，而其中SUI約占尿失禁總數(shù)的42.6%[3]。中國女性的壓力性尿失禁發(fā)病率達(dá)18.9%，其中老年女性的發(fā)病率約為30%[4]。目前的治療方案以行為矯正和保守治療為主。中醫(yī)將壓力性尿失禁歸屬類于“遺溺”“遺尿”或“淋證”的范疇，中藥治療壓力性尿失禁多從脾腎二臟論治，脾腎氣虛，固攝無力。補(bǔ)中益氣湯出自《脾胃論》，該方由白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、陳皮、甘草、柴胡、人參、升麻組成，主要功效為補(bǔ)中益氣、升陽舉陷。肖春風(fēng)等[5]用補(bǔ)脾氣溫腎陽為治法，針對中氣虧虛、腎陽不足型尿失禁。觀察組給予補(bǔ)中益氣湯為底加上健脾溫中、溫腎固精之藥，結(jié)論總有效率達(dá)87.68%。張愛華[6]則認(rèn)為SUI多因脾腎氣虛、膀胱失約導(dǎo)致，臨床運(yùn)用補(bǔ)中益氣丸聯(lián)合知柏地黃丸治療，總有效率達(dá)到93.94%。邵朝弟教授提出了補(bǔ)中益氣湯不僅能補(bǔ)益中氣，還具有補(bǔ)益肺氣的功效，對于腹壓過高而導(dǎo)致的尿失禁療效顯著[7]。本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫篩選出補(bǔ)中益氣湯中8味藥的化學(xué)活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)，而后與GeneGards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與SUI對應(yīng)靶點(diǎn)相交，作蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析并篩選核心蛋白，進(jìn)行GO和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。最終以闡明補(bǔ)中益氣湯治療SUI的分子藥理機(jī)制，為補(bǔ)中益氣湯的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選補(bǔ)中益氣湯中藥活性成分，估測潛在作用靶點(diǎn) 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索出補(bǔ)中益氣湯8味藥的活性成分，以口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選條件，定OB>30%、DL>0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，由此可得到符合條件的活性成分靶點(diǎn)信息，而后通過Uniport數(shù)據(jù)庫使得基因名標(biāo)準(zhǔn)化[8-9]。

1.2 預(yù)測壓力性尿失禁疾病靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中以“Stress Urinary Incontinence”為關(guān)鍵詞檢索出與壓力性尿失禁相關(guān)的基因。

1.3 構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-活性成分-關(guān)鍵靶基因網(wǎng)絡(luò)圖[10]。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（Node）代表疾病、活性成分和關(guān)鍵靶基因;網(wǎng)絡(luò)中的邊（Edge）用于連接疾病和活性成分、活性成分和關(guān)鍵靶基因。連接到網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)以度值（Degree）為單位表示[11]，一個(gè)節(jié)點(diǎn)連接到其他節(jié)點(diǎn)的邊越多，其重要性就越大，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中所起的作用及程度值越大，通過Cytoscape軟件構(gòu)建出中藥-活性成分-關(guān)鍵靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn) 將中藥活性成分潛在作用靶點(diǎn)與疾病預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)取交集，導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homosapiens”，以置信度>0.4為篩選條件，可以得到交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)信息，通過degree、closeness、betweenness等條件篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因（HubGene），利用Cytoscape軟件將其可視化[12]。

1.5 富集分析靶點(diǎn)基因 將補(bǔ)中益氣湯作用于SUI的所有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，用R包（ggplot2）繪圖將其可視化。

1.6 構(gòu)建基因-通路網(wǎng)絡(luò) 將篩選得到的信號通路和富集得到的信息，使用Cytoscape軟件構(gòu)建出基因-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，并將其可視化。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯活性成分的篩選及潛在作用靶點(diǎn)的收集 通過TCMSP檢索到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)中益氣湯活性成分共有182個(gè)，其中甘草92個(gè)，人參22個(gè)，黃芪20個(gè)，柴胡17個(gè)，升麻17個(gè)，白術(shù)7個(gè)，陳皮5個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)。然后將得到的活性成分預(yù)測作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)值，最后可得到靶點(diǎn)基因共232個(gè)。

2.2 壓力性尿失禁靶點(diǎn)的收集 利用GenCards、OMIM疾病數(shù)據(jù)庫分別獲得SUI潛在靶點(diǎn)1 766、45個(gè)，整合后共有1 811個(gè)SUI相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析 將篩選得到的補(bǔ)中益氣湯所有作用靶點(diǎn)232個(gè)和疾病所有相關(guān)靶點(diǎn)1 811個(gè)進(jìn)行重復(fù)比較，最終得到116個(gè)交集靶點(diǎn)，說明補(bǔ)中益氣湯可通過116個(gè)靶點(diǎn)作用于SUI。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將2.3中獲得的116個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)入至STRING網(wǎng)站進(jìn)行靶基因之間的PPI分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出關(guān)聯(lián)性為前10的Hub基因，分別為SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1，表明這些基因在補(bǔ)中益氣湯治療SUI的過程中具有重要意義。

2.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將最終得到的116個(gè)作用靶點(diǎn)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO與KEGG富集分析，結(jié)果共有2 115條生物功能顯著富集（P<0.05），1 869個(gè)在生物過程（BP）中富集，84個(gè)在細(xì)胞成分（CC）中富集，162個(gè)在分子功能（MF）中富集。顯示的GO富集分析中存在3大類，即生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。在生物過程分析中，主要涉及對抗生素的反應(yīng)（Response to Antibiotic）、對脂多糖的反應(yīng)（Response to Lipopolysaccharide）、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（Response to Molecule of Bacterial Origin）、對金屬離子的反應(yīng)（Response to Metalion）、對乙醇的反應(yīng)（Response to Alcohol）等。在細(xì)胞組分分析中，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain）、膜區(qū)（Membrane Region）、小窩（Caveola）、質(zhì)膜筏（Plasma Membrane Raft）等。在分子功能分析中，主要涉及核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)控序列-特異性DNA結(jié)合（Transcription Factor Activity，Direct Ligand Regulated Sequence-specific DNA Binding）、磷酸酶結(jié)合（Phosphatase Binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（Protein Phosphatase Binding）、激酶調(diào)節(jié)活性（Kinase Regulator Activity）等。

按照KEGG通路富集分析的P-value值排名，可以富集得到20條通路。補(bǔ)中益氣湯的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集的通路有以下：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、膀胱癌（Bladder Cancer）信號通路、前列腺癌（Prostate Cancer）信號通路、胰腺癌（Pancreatic Cancer）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）信號通路、乙型肝炎（Hepatitis B）信號通路、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine Resistance）信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus Infection）信號通路、戊型肝炎（Hepatitis C）信號通路、IL-17信號通路（IL-17 Signaling Pathway）、非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）信號通路、愛潑斯坦巴爾病毒感染（Epstein-Barr Virus Infection）信號通路、鉑耐藥（Platinum Drug Resistance）信號通路、小細(xì)胞肺癌（Small Cell Lung Cancer）信號通路、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human Cytomegalovirus Infection）信號通路、麻疹（Measles）信號通路、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in Cancer）信號通路、大腸癌（Colorectal Cancer）信號通路。結(jié)果表明，補(bǔ)中益氣湯的活性成分靶點(diǎn)分布于不同的信號通路，說明補(bǔ)中益氣湯可以通過對各條通路的協(xié)調(diào)作用達(dá)到治療SUI的目的。

2.6 基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape軟件構(gòu)建通路-活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中包含了9個(gè)核心目標(biāo)基因和20條通路。圖形面積越大則代表目標(biāo)基因或者通路在其中發(fā)揮的作用越大。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并無尿失禁的病名記載，據(jù)癥狀多歸屬于“遺溺”范疇。壓力性尿失禁是尿失禁中最常見的類型，其臨床表現(xiàn)主要是當(dāng)患者做咳嗽、運(yùn)動(dòng)、大笑等使腹壓突然增加的動(dòng)作時(shí)，尿液會(huì)不自主地從尿道口流出，嚴(yán)重者在日常生活活動(dòng)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)，這嚴(yán)重影響了患者的生命質(zhì)量，損害患者的身心健康[13]。中醫(yī)理論認(rèn)為SUI的病因病機(jī)為沖任不固、提攝無力，治療宜健脾益氣與補(bǔ)腎固攝。《全書·婦人規(guī)》有“或因分娩過勞，或因郁熱下墜，或因氣虛下脫，大都此癥當(dāng)以升陽補(bǔ)氣，固澀真陰為主”之論述[14]。補(bǔ)中益氣湯方中黃芪味甘微溫，入脾肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣，升陽固表，故為君藥。配伍人參、炙甘草、白術(shù)，補(bǔ)氣健脾為臣藥。當(dāng)歸養(yǎng)血和營，協(xié)人參、黃芪補(bǔ)氣養(yǎng)血;陳皮理氣和胃，使諸藥補(bǔ)而不滯，共為佐藥。少量升麻、柴胡升陽舉陷，協(xié)助君藥以升提下陷之中氣，共為佐使。炙甘草調(diào)和諸藥為使藥。本研究借以補(bǔ)中益氣湯的化學(xué)成分、靶點(diǎn)及通路信息等多項(xiàng)數(shù)據(jù)，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)對其功能分析，系統(tǒng)預(yù)測其對SUI多成分、多靶標(biāo)的可能分子機(jī)制。

SUI的病理機(jī)制尚不明確，有研究表明該病的發(fā)生與盆底-組織異常膠-原代謝相關(guān)[15]，影響膠原-代謝的因素有很多，期間涉及多個(gè)功能蛋白和代謝通路。周菲菲等[16]研究探討加味補(bǔ)中益氣湯是否通過成纖維細(xì)胞膠原代謝治療女性壓性尿失禁。結(jié)果表明加味補(bǔ)中益氣湯干預(yù)后I膠原蛋白及Ⅲ膠原蛋白的mRNA表達(dá)，增加尿道支撐組織的膠原含量以改善SUI癥狀。艾陽等[17]通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究補(bǔ)中益氣湯治療盆底功能障礙性疾病（包括盆腔臟器脫垂和壓力性尿失禁）的作用機(jī)制，結(jié)果顯示補(bǔ)中益氣湯對TGF-β3、COL1A1、COL3A1的表達(dá)都具有上調(diào)作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析補(bǔ)中益氣湯治療SUI的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯中的116種成分具有治療SUI的功效，篩選得到前10個(gè)關(guān)鍵活性成分為：槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫寧、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇。分析得槲皮素是補(bǔ)中益氣湯的主要的活性成分，存在于黃芪和甘草中，研究表明槲皮素是廣泛的激酶抑制劑能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，主要包括細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期停滯，核因子κB途徑，MAPK途徑，PI3K-AKT途徑和mTOR[18]。山萘酚可以調(diào)節(jié)核因子κB、Notch等信號通路起到抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種藥理作用[19]。幾種關(guān)鍵活性成分與疾病作用靶點(diǎn)聯(lián)系緊密，且來源于補(bǔ)中益氣湯的君藥和臣藥。通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析可知補(bǔ)中益氣湯主要通過SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1靶點(diǎn)發(fā)揮作用。ICAM1能夠抑制淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞，與各種癌癥表達(dá)相關(guān)[20]。Zhou等[21]對陰道壁組織的基因進(jìn)行了分析，認(rèn)為ICAM1、IL6、CCNA2、ATF3等基因在SUI的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用。Tong等[22]發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E，生長因子受體結(jié)合蛋白2，高爾基體SNAP受體復(fù)合物等可能在SUI發(fā)展中起神經(jīng)退行性作用。KEGG富集到的通路多涉及神經(jīng)、炎癥、內(nèi)分泌等。Kang等[23]通過調(diào)節(jié)FAK-AMPK和Wnt/β-catenin激活骨盆底和尿道肌內(nèi)的組織干細(xì)胞。馬雙玲等[24]對60例SUI患者研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1和CTGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度抑制可能與SUI患者盆底支持結(jié)構(gòu)的退行性病變密切相關(guān)。黃瓊[25]研究發(fā)現(xiàn)P44/42MAPK細(xì)胞信號通路與SUI發(fā)病相關(guān)通路受抑制后尿道支撐組織成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)量明顯下降。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步闡明補(bǔ)中益氣湯多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療SUI可能存在的作用機(jī)制。考慮到網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性和數(shù)據(jù)分析的不全面性，后期仍需進(jìn)一步臨床研究或?qū)嶒?yàn)佐證。

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（2020-05-10收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）