四妙勇安湯改善冠心病痰瘀互結證大鼠心肌損傷的研究

王琛 王亞紅

摘要 目的：探討四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠的心肌保護作用及機制。方法：建立冠心病痰瘀互結證大鼠模型，隨機分為正常對照組、模型組、四妙勇安湯大劑量組、四妙勇安湯中劑量組、四妙勇安湯小劑量組，相應干預后，處理動物。檢測血脂三項、凝血三項、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-8（IL-8）、內皮素-1（ET-1）及可溶性血管細胞黏附分子-1（sICAM-1）;采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率;Western blotting法檢測心肌組織凋亡及自噬相關蛋白的表達。結果：與模型組比較，四妙勇安湯可降低血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白（LDL）含量（P<0.05），同時可增加血漿活化部分凝血活酶時間（APTT）（P<0.05）;降低血清炎癥介質TNF-α、IL-8及ET-1、sICAM-1含量（P<0.05）;四妙勇安湯干預組可有效降低心肌細胞凋亡率、促進抗凋亡蛋白BCL-2及抑制促凋亡蛋白BAX的表達;并且抑制自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達，與模型組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：四妙勇安湯具有改善冠心病痰瘀互結證大鼠血脂、血凝及內皮功能等作用，具有保護受損心肌的作用，其機制可能與抑制自噬引起的心肌細胞凋亡有關。

關鍵詞 四妙勇安湯;冠心病;痰瘀互結證;大鼠模型;心肌損傷;保護作用;自噬;細胞凋亡

Abstract Objective：To explore the myocardial protective effects and mechanism of Simiao Yongan Decoction on rats with coronary heart disease with mutual syndrome of phlegm and blood stasis.Methods：The rat model of coronary heart disease of phlegm and blood stasis syndrome was established and were randomly divided into a normal control group，a model group，Simiao Yongan Decoction of high，middle and small dose group.After the corresponding intervention，we handled the animals，detected 3 blood lipids，3 blood coagulation，tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-8（IL-8），endothelin-1（ET-1） and soluble vascular cell adhesion molecule-1（sICAM-1）; TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis rate; Western blotting method was used to detect myocardial tissue apoptosis and the expression of autophagy-related proteins.Results：Compared with the model group，Simiao Yongan Decoction groups can reduce serum total cholesterol，triglycerides and low-density lipoprotein content（P<0.05），and increase plasma activated partial thromboplastin time（APTT）（P<0.05）; reduce serum inflammatory factors TNF-α，IL-8 and ET-1，sICAM-1 content（P<0.05）; Simiao Yongan Decoction intervention group can effectively reduce the rate of cardiomyocyte apoptosis，promote anti-apoptotic protein BCL-2 and inhibit the expression of pro-apoptotic protein BAX; inhibit the expression of autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1，which were significantly different compared with the model group（P<0.05）.Conclusion：Simiao Yongan Decoction can improve coronary heart disease with phlegm and blood stasis syndrome rats′ blood lipids and coagulation，as well as endothelial dysfunction.Moreover the mechanism may probably be related with suppression autophagy-related apoptosis.

Keywords Simiao Yongan Decoction; Coronary heart disease; Phlegm and blood stasis syndrome; Rat model; Myocardial injury; Protective effects; Autophagy; Apoptosis

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.011

冠心病仍是全球范圍內第一位致死、致殘原因，占全球總死亡人數的30%。本病相當于中醫的“胸痹”“心痛”，為本虛標實之證。氣血陰陽虧虛為本，痰濁、瘀血、氣滯、寒凝為標。西醫學認為動脈粥樣硬化及心肌缺血是冠心病主要的病理特征，動脈粥樣硬化主要由脂代謝紊亂引起，為中醫學“痰”的表現，心肌缺血導致血流運行緩慢，為中醫學“瘀”的表現，越來越多的研究表明冠心病痰瘀互結證是目前冠心病較常見且病變程度較嚴重的證型[1-5]。

痰瘀同治法是目前治療冠心病痰瘀互結證的常用方法，但其臨床療效評價尚待進一步明確[6]。陳可冀院士等認為痰瘀日久，因瘀致毒，痰、瘀、毒互結為冠心病病情發展與惡化的關鍵所在[7]，在治療中注重“化毒”。四妙勇安湯是治療熱毒熾盛之脫疽的經典名方，亦是治療冠心病熱毒血瘀證的臨床常用方劑[8-9]。方中金銀花為君藥，甘寒入心，清熱解毒生津;玄參咸寒，滋陰降火、軟堅散結，當歸辛苦溫，苦能燥濕、辛夠通，二藥共為臣藥;連翹清熱解毒、散結消腫，為佐藥;甘草甘溫，緩急和中、止痛散寒，為使藥。全方以“清熱解毒、活血止痛”為治療要點。本研究以四妙勇安湯治療冠心病痰瘀互結證，突破以往冠心病痰瘀互結證的“痰瘀同治”法，以期為冠心病痰瘀互結證提供新的理法方藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體（SPF）級SD大鼠150只，雄性，8～10周齡，體質量（80±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006，適應性喂養1周。中國中醫科學院中醫基礎理論研究所倫理委員會審批（倫理審批號：2018-095）。

1.1.2 藥物 中藥飲片（金銀花、玄參、當歸、連翹、甘草）購自北京同仁堂藥店。

1.1.3 試劑與儀器 TUNEL試劑盒（Promaga Corporation，美國，貨號：0000382112）;Beclin-1兔多克隆抗體（Cell Signal，美國，貨號：3738）、LC3 A/B兔多克隆抗體（Cell Signal，美國，貨號：4108）、Bax兔多克隆抗體（Cell Signal，美國，貨號：2772），GAPDH兔單克隆抗體（Cell Signal，美國，貨號：5174）;BCL-2兔多克隆抗體（Abcam，美國，貨號：ab196495）;增強化學發光（ECL）試劑盒（Thermo，美國，貨號：TK273732）;辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG（Santa Cruz，美國，貨號：sc-2357）;小動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司，型號：DW2000）;多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠，型號：RM6240BD）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 造模組大鼠隨機分為模型組（冠心病痰瘀互結證組）和四妙勇安湯低、中、高劑量組，分別給予藥物或者同等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續8周。正常對照組大鼠給予普通飼料喂養;根據相關報道方法[10]，造模組大鼠在高脂喂養4周后，選擇血脂升高的大鼠行冠脈結扎，術前禁食不禁水12 h，以2%戊巴比妥鈉（2.3 mL/kg）腹腔注射麻醉后固定于鼠臺，氣管插管，微型動物呼吸機支持呼吸，頻率50～60次/min，潮氣量4～6 mL。胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，在胸骨左緣3、4肋間開胸暴露心臟。打開心包膜，揭開脂肪墊，暴露左心耳后，持7號針線，在肺動脈圓錐和左心耳之間冠狀動脈左前降支（Left Anterior Descending Coronary，LAD）處穿一縫合線并結扎。

1.2.2 給藥方法 1）正常對照組：大鼠正常喂養至實驗結束。2）模型組（冠心病痰瘀互結證組）：給予藥物同體積生理鹽水灌胃2周，大鼠開胸后結扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血，繼續給予與藥物同體積生理鹽水灌胃6周至實驗結束。3）四妙勇安湯高劑量組：四妙勇安湯（當歸90 g、金銀花90 g、玄參60 g、甘草30 g，濃縮成2 g/mL的生藥煎劑），給予28 g/（kg·d）藥物灌胃，2周后，大鼠開胸結扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血，繼續給予中藥灌胃6周至實驗結束。4）四妙勇安湯中劑量組：給予14 g/（kg·d）藥物灌胃，2周后，大鼠開胸結扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血，繼續給予中藥灌胃6周至實驗結束。5）四妙勇安湯低劑量組：給予7 g/（kg·d）藥物灌胃，2周后，大鼠開胸結扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血，繼續給予中藥灌胃6周至實驗結束。

1.2.3 檢測指標與方法 1）血清三項及凝血三項：血清三項包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）;凝血三項包括血漿活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、纖維蛋白原（Fib）。實驗結束前，大鼠禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血液約5 mL，離心半徑13.5 cm，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。以全自動生化分析儀測定血清TC、TG及LDL含量;收集血漿，以全自動凝血分析儀檢測血漿APTT、PT及Fib。2）血清炎癥介質白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測定：大鼠禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血液約5 mL，離心半徑13.5 cm，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。按Elisa試劑盒說明檢測血清IL-8、TNF-α含量。3）血清內皮素（ET-1）、可溶性血管細胞黏附分子（sVCAM-1）測定：大鼠禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血液約5 mL，離心半徑13.5 cm，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。按Elisa試劑盒說明檢測血清ET-1、sVCAM-1含量。4）TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡：實驗結束后，用3%戊巴比妥鈉麻醉，開胸腔，取出心臟，將缺血區心肌組織（左心室前壁中間段）剪下，常規石蠟包埋，制備3 μm切片。按照試劑盒說明進行組織切片細胞凋亡檢測，共聚焦顯微鏡下觀察。正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細胞分布區域隨機取5個高倍視野，計算平均每個視野中的凋亡細胞數占總細胞數的百分比（%），以凋亡指數（Apoptotic Index，AI）表示。5）大鼠心肌組織凋亡及自噬相關蛋白表達測定：實驗結束后，開胸腔，取心尖組織50 mg左右，提取心肌組織總蛋白，用于Western blotting檢測，分別檢測自噬相關蛋白LC3 A/B，Beclin-1;凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax，4 ℃過夜孵育，1×TBS-T洗膜后，室溫下以相應的Ⅱ抗孵育1.5 h，并以GAPDH單克隆抗體重復上述實驗過程，作為上樣對照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料均采用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用q檢驗進行多組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠血脂的影響 模型組大鼠血清TC、TG及LDL含量較正常對照組均顯著升高，其中TC為正常對照組的1.4倍（P<0.05），TG為正常對照組的1.7倍（P<0.05），LDL為正常對照組的1.3倍（P<0.05）;四妙勇安湯干預后可不同程度降低模型組大鼠血清TC、TG及LDL含量，其中以四妙勇安湯小劑量組TC含量較模型組低15%（P<0.05），TG含量較模型組低35%（P<0.05），LDL較模型組低3%（P<0.05）。見圖1。

2.2 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠凝血功能的影響 模型組APTT、PT較正常對照組顯著縮短，Fib含量較正常對照組顯著升高，其中APTT較正常對照組縮短10%（P<0.05），PT時間較正常對照組縮短2%（P<0.05），Fib含量較正常對照組升高17%（P<0.05）;四妙勇安湯干預后顯著增加了APTT，與模型組比較，大劑量組增加了10%（P<0.05），中劑量組增加了18%（P<0.05）。見圖2。

2.3 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠血清TNF-α、IL-8的影響 模型組TNF-α、IL-8含量較正常對照組均顯著升高，其中TNF-α為正常對照組的1.11倍（P<0.05），IL-8為正常對照組的1.1倍（P<0.05）;四妙勇安湯干預后可不同程度降低模型組大鼠血清TNF-α及IL-8含量，其中四妙勇安湯中劑量及小劑量組中血清TNF-α分別較模型組降低9%與14%（P均<0.05）;四妙勇安湯中劑量組中血清IL-8較模型組降低7%（P<0.05）。見圖3。

2.4 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠血清sVCAM-1、ET-1的影響 模型組大鼠血清sVCAM-1、ET-1含量較正常對照組均顯著升高，其中sVCAM-1為正常對照組的1.06倍（P<0.05），ET-1為正常對照組的1.09倍（P<0.05）;四妙勇安湯干預后可不同程度降低模型組大鼠血清sVCAM-1及ET-1含量，其中四妙勇安湯中劑量及小劑量組中血清sVCAM-1分別較模型組降低5%與7%（P<0.05）;四妙勇安湯小劑量組中血清ET-1較模型組降低12%（P<0.05）。見圖4。

2.5 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠心肌細胞凋亡的影響 與正常對照組比較，模型組非梗死區心肌TUNEL陽性率升高20倍（P<0.05）。四妙勇安湯干預后可不同程度降低模型組大鼠心肌TUNEL陽性率，其中四妙勇安湯中劑量及小劑量組TUNEL陽性率分別較模型組降低60%與80%（P<0.05）。見圖5。

2.6 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠心肌凋亡相關因子Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型組Bcl-2蛋白表達降低46.3%（P<0.05），Bax蛋白表達是正常對照組的2.28倍（P<0.05）。四妙勇安湯可顯著誘導抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，與模型組比較，四妙勇安湯大、中、小劑量組Bcl-2蛋白表達分別增加32.9%、36.7%及63.3%（P<0.05）;抑制促凋亡蛋白Bax的表達，四妙勇安湯大、中、小劑量組Bax表達分別降低37%、39.7%及52.1%（P<0.05）。見圖6。

2.7 四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證大鼠心肌自噬相關因子Beclin-1、LC3 A/B蛋白表達的影響 ? 與正常對照組比較，模型組Beclin-1和LC3 A/B蛋白表達分別升高49%和73%（P<0.05）。四妙勇安湯干預后可不同程度降低模型組大鼠Beclin-1和LC3 A/B蛋白表達，與模型組Beclin-1蛋白表達比較，四妙勇安湯大劑量、中劑量與小劑量組分別降低了28%、34%和37%（P<0.05）;與模型組LC3 A/B蛋白表達比較，四妙勇安湯大劑量及中劑量組分別降低了21%和26%（P<0.05）。見圖7。

3 討論

隨著現代人們飲食結構及生活方式的改變，冠心病痰瘀互結證已成為目前冠心病較常見的證型。本病的發生因飲食不節，過食肥甘，損傷脾胃，內生痰濁，痰濁阻滯，滯而成瘀，痰瘀互結，壅阻心脈。或因正氣虧虛，氣虛血瘀，痹阻胸中，胸陽不振，痰濁內生，痰瘀痹阻心脈。由此可見，痰可致瘀，瘀能化痰，痰瘀日久生毒，循環反復。本實驗采用高脂飼料喂養造成脂代謝紊亂，模擬“痰”的特征，冠狀動脈左前降支結扎造成心肌缺血，模擬“瘀”的特征，二者聯合建立冠心病痰瘀互結證大鼠模型，使造模結果接近于臨床CHD痰瘀互結證的病機特點。以原方劑量為大劑量組、1/2原方劑量為中劑量組、1/3原方劑量為小劑量組，各給藥8周，通過血清學檢測證實模型組大鼠TC、TG及LDL均升高;與模型組比較，各劑量中藥組均不同程度降低了血脂含量，說明四妙勇安湯可以改善痰瘀互結證血脂情況。凝血三項間接可反映血凝（血瘀）狀態，文獻研究表明冠心病痰瘀互結證血漿PT和APTT降低、FIB升高，則提示血液處于高凝狀態，血流速度減慢[11]，其中APTT是對內源性凝血系統較敏感的指標。本研究證實中藥組可以顯著延長冠心病痰瘀互結證大鼠血漿APTT時間，提示四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證具有一定抗凝作用。作為重要的炎癥介質，TNF-α參與血管舒張與水腫形成、促進炎癥部位的氧化應激。IL-8是一種趨化因子，可與其特異性受體結合，亦是一種重要炎癥介質，IL-8、TNF-α過度表達提示炎癥介質失衡。本研究顯示，模型組增加了炎癥介質表達，與相關報道一致[12]。中藥組可顯著降低血清TNF-α、IL-8含量，提示四妙勇安湯對冠心病痰瘀互結證具有一定抗炎作用。現代研究證實，痰瘀互結證與內皮細胞損傷密切相關，其分泌的ET-1、sICAM-1等血管活性物質可能是冠心病“血瘀”病理重要標志物[13]。本研究顯示中藥組可顯著降低模型組大鼠sICAM-1、ET-1的表達，提示四妙勇安湯可以改善冠心病痰瘀互結證大鼠血管內皮損傷。

細胞凋亡是細胞在基因控制下自我消亡的一種生物現象，在動脈硬化形成過程中，不規則的細胞凋亡引起動脈管壁在形態、結構及代謝等方面的異常[14]。心肌細胞凋亡是冠心病心功能減弱的生物學基礎之一，是影響冠心病痰瘀互結證轉歸、預后的關鍵。痰瘀互結日久，加重心肌缺血及損傷，誘發心肌細胞凋亡、壞死，痰瘀互結與細胞凋亡具有一定的內在聯系[15]，抗凋亡治療在減少缺血損傷方面具有重要意義。TUNEL法是結合了形態學和分子生物學的一種檢測細胞凋亡的常用方法，既可定性又可定量，可準確定位，且靈敏度高，能準確地反映細胞在凋亡時的形態學和生物學特點[16]。抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax參與心肌細胞凋亡的調控，抑制細胞凋亡的發生和發展，是促進心肌損傷后心功能恢復和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑[17]。TUNEL檢測細胞凋亡發現，中藥組可顯著降低模型組大鼠心肌細胞凋亡率。本研究采用Western blotting檢測凋亡相關因子Bcl-2、Bax的蛋白表達，亦發現中藥組可明顯降低模型組大鼠Bax蛋白表達，增加Bcl-2蛋白表達。以上均提示四妙勇安湯可通過調節凋亡相關因子的表達，抑制冠心病痰瘀互結證大鼠心肌細胞凋亡，減輕心肌損傷。進一步研究發現其抑制心肌細胞凋亡的機制可能與自噬相關。

自噬是細胞的自我吞噬、降解的過程，對維持細胞內穩態起關鍵作用。自噬是一種細胞內防御和應激調控機制，也是參與心肌缺血損傷的重要機制之一，缺血初期，適度的自噬通過處理損傷的細胞器，為細胞成活的關鍵代謝過程提供營養物質，對心肌細胞具有保護作用。嚴重或長時間缺血時，高水平自噬激活可通過炎癥反應等引起心肌細胞凋亡[18-19]。酵母Atg6同源蛋白B細胞淋巴瘤蛋白質-2-相互作用蛋白質-1（B-cell lymPhoma-2-interacting protein-1，Beclin1）是第一個被發現的哺乳動物自噬相關基因，微管相關蛋白1輕鏈3（Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3，LC3）是第一個被發現的自噬體標記蛋白，二者是反映細胞自噬的重要指標[20]。Beclin1是自噬小體形成以及自噬進程中的一個關鍵的蛋白調節因子，能與多種蛋白質，其中Beclin1-Bcl-2是自噬與凋亡間第一個確定的分子連接;另一方面，過度激活的自噬引起Beclin1表達水平升高，釋放促凋亡蛋白BAK/BAX，從而促進細胞凋亡，加重損傷[21-22]。自噬充分體現了機體的自我修復與清除之間的平衡。已有研究證實中藥可通過干預心肌細胞自噬發揮保護心肌的作用[23-27]。本研究采用Western blotting，檢測自噬相關因子Beclin-1及LC3A/B的蛋白表達，發現模型組Beclin-1、LC3A/B蛋白表達較正常對照組均顯著升高，發現中藥組可明顯降低Beclin-1，LC3A/B的蛋白表達，提示四妙勇安湯對自噬有一定抑制作用。

綜上所述，四妙勇安湯可通過改善冠心病痰瘀互結證大鼠血脂、血凝、內皮功能及抑制心肌細胞凋亡等作用，保護受損心肌，其機制可能與抑制心肌缺血引起的自噬有關，但仍需進一步探索。

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（2020-05-05收稿 責任編輯：芮莉莉）