基于轉錄組的非洲菊PLC基因家族鑒定與進化分析

王秀美 倪珊珊 李乾玉 李小芳 林爭春 陳裕坤 林玉玲 賴鐘雄 杜迎剛

摘 ?要：磷脂酶C（phospholipase C，PLC）廣泛參與植物的生命活動和代謝過程，在抵御真菌感染的過程中發揮重要作用。本研究基于非洲菊轉錄組測序數據，鑒定出13個非洲菊PLC基因家族成員，其中NPC有3個，PI-PLC有10個。非洲菊PLC的蛋白序列長度在98～594 aa之間，蛋白理論分子量為11 410.25～67 998.85 kDa，等電點為4.74～9.59，均為不穩定親水蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，13個成員分別定位于細胞壁、細胞膜、細胞質、葉綠體和細胞核中，表明不同成員功能上可能存在多樣性。進化樹分析表明，13個非洲菊PLC蛋白可分為2個亞組，進化關系較近的蛋白結構組成相似。非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白PLC2、PLC4、AT2G40116可相互作用。非洲菊轉錄組的FPKM值分析表明，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10在非洲菊中表達量高，感病植株中變化大，可能在抵御真菌感染過程中發揮重要作用。研究結果可為進一步研究非洲菊PLC基因的生物學功能提供依據。

關鍵詞：非洲菊;磷脂酶C;基因家族;進化分析

中圖分類號：S682.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Phospholipase C （PLC） is widely involved in the life activities and metabolism processes of plants， and plays an important role in the process of resisting fungal infection. Based on the results of the transcriptome sequencing in Gerbera jamesonii， 13 members of G. jamesonii PLC gene family， including 3 NPC and 10 PI-PLC were identified in the study. The sequences of G. jamesonii PLC proteins ranged from 98 to 594 aa in length， theoretical molecular weight varied from 11 410.25 to 67 998.85 kDa， isoelectric point in the range of 4.74 to 9.59， and all were unstable hydrophilic proteins. The prediction results of subcellular localization showed that the 13 members were located in the cell wall， cell membrane， cytoplasm， chloroplast and nucleus， indicating that there might be diversity in functions of different mem-bers. Evolutionary trees analysis showed that 13 PLC proteins of G. jamesonii were divided into two subgroups， the structure and composition of proteins with relatively close evolutionary relationship were similar. G. jamesoniis homo-logous protein PLC2， PLC4 and AT2G40116 in Arabidopsis thaliana can interact with each other. The FPKM value analysis of G. jamesonii transcription showed that GjPLC2， GjPLC3， GjPLC8 and GjPLC10 were highly expressed in G. jamesonii and changed greatly in infected plants， which may play an important role in preventing fungal infection. These results could provide the basis for further study of the biological function of G. jamesonii PLC genes.

Keywords： Gerbera jamesonii Bolus; Phospholipase C; gene family; evolutionary analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.010

磷脂酶C（phospholipase C，PLC）是一種普遍存在于動物、植物和微生物細胞中的脂質水解酶，根據作用底物的不同可主要分為磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC，PI-PLC）和非特異性磷脂酶C（non-specific PLC，NPC）[1-2]。PI-PLC蛋白由N端的EF手型結構域、C端的C2結構域及中間的X、Y結構域組成[2]，主要水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidyfinositol4， 5-bisphosphate，PIP2），生成水溶性三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和脂溶性二酰甘油（diacylglycerol，DAG）[3]。而NPC蛋白只包含一個具有磷脂酶活性的磷酸酯酶區，主要水解磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG），生成DAG和相應磷酸鹽[4]。

研究表明，由PI-PLC蛋白水解產生的IP3進入細胞液后能觸發細胞內的Ca2+存儲庫釋放Ca2+，進而誘發一系列生理生化反應;進入細胞質后則會經過多磷酸肌醇激酶（Inositol polyphosphate kinase，IPK2/IPMK）逐級磷酸化形成六磷酸肌醇（inositol hexaphosphate，IP6），IP6作為信號分子促進Ca2+釋放，參與植物對病原菌脅迫的應答[5]。由PI-PLC和NPC蛋白水解產生的DAG在甘油二酯激酶（diacylglycerol Kinase，DGK）的催化作用下迅速磷酸化生成磷脂酸（phosphatidicacid，PA），并通過與一些蛋白激酶、脂激酶和NADPH氧化酶等之間的相互作用，調節植物細胞生長、非生物脅迫和細胞死亡等生理過程[6]。因此，PLC基因可以參與植物細胞的分裂、生長和分化以及細胞的免疫等諸多細胞信號轉導過程。例如，在轉基因煙草和擬南芥中過量表達AtPLC5會引起擬南芥和煙草葉片早衰[7];下調番茄SlPLC4和SlPLC2表達水平則損害其對葉霉病菌[8]、灰霉病[9]以及真菌誘導的木聚糖酶[10]的免疫功能。

非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）是世界五大鮮切花之一[11]，原產于非洲南部的德蘭士瓦，具有花朵大、色彩艷麗、花期長、切花產量高等優點，被廣泛用作切花和盆栽觀賞。但根腐病的泛濫嚴重限制了非洲菊產業的健康發展，據不完全統計，由隱地疫霉（Phytophthora cryptogea）引起的根腐病一般情況下的發病率為20%～30%，嚴重時可達80%以上[12]，因此，選育優良的非洲菊抗病品種是生產上亟待解決的問題。目前，關于非洲菊的PLC基因研究還未見報道，本研究基于非洲菊健康植株和感染根腐病病原菌植株的轉錄組測序數據，在轉錄組水平上對PLC基因家族進行鑒定和生物信息學分析，同時研究非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中的差異表達情況，為進一步研究非洲菊PLC基因的生物學功能提供基礎數據和參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

非洲菊（健康植株和感染根腐病病原菌植株）轉錄組數據由本實驗室課題組測序獲得（SRA：SRR9937065），模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的PLC家族蛋白序列下載自TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org），水稻（Oryza sative L.）的PLC家族蛋白序列下載自RiceData數據庫（http：//www.ricedata.cn/gene）和NCBI的GeneBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?非洲菊PLC基因家族的鑒定 ?利用NCBI的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）將非洲菊轉錄組測序數據進行初步篩選，得到PLC家族相關蛋白序列。利用在線軟件HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART（http：//smart. embl-heidelberg.de/）對其蛋白序列保守結構域逐個進行鑒定分析，去除掉重復和不含有PLC家族特征結構域的序列。

1.2.2 ?非洲菊PLC家族蛋白序列分析 ?利用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl）、Plant- mPLocServer（http：//www.Csbio. sjtu.edu.cn/bioin- f/plant-multi）分析預測非洲菊PLC蛋白序列的理化性質、二級結構進行及亞細胞定位。利用在線軟件MEME Suite 5.1.1（http：// meme-suite.org/tools/meme）分析非洲菊PLC家族蛋白的保守基序，設置基序數目為30。

1.2.3 ?非洲菊PLC家族蛋白序列比對及進化樹構建 ?利用多序列對比軟件Clustalx對鑒定得到的非洲菊PLC蛋白序列與擬南芥、水稻的PLC蛋白進行多序列比對，使用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法，Bootstrap設為1000，其他參數為默認值下建系統發育樹，并使用在線軟件iTOL（https：// itol.embl.de/upload.cgi）對進化樹進行美化。

1.2.4 ?非洲菊PLC家族蛋白互作分析 ?將非洲菊PLC蛋白序列導入在線軟件STRING（https：// string-db.org/），以模式植物擬南芥為參考序列構建蛋白互作網絡，預測非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白的互作關系。

1.2.5 ?非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中差異表達的FPKM值分析 ?利用非洲菊轉錄組測序數據，分析PLC基因在健康和感病植株中的差異表達。以非洲菊健康植株和感病植株每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的reads（reads per ki-lobase of exon model per million mapped reads，FPKM）為基因轉錄豐度，利用Heml軟件做熱圖。

2 ?結果與分析

2.1 ?非洲菊PLC家族基因的鑒定

基于本課題組前期獲得的非洲菊轉錄組測序數據，利用NCBI的BLAST初步篩選得到23條PLC家族相關的蛋白序列。PI-PLC蛋白包含EF手型結構域、X結構域、Y結構域和C2結構域，而NPC蛋白中只含有一個磷酸酯酶區，通過HMMER和SMART對其蛋白序列保守結構域進行篩選，去除掉重復和不含有PLC家族特征結構域的序列，最終得到13條非洲菊PLC蛋白序列（表1）。其中NPC有3條，PI-PLC有10條。為方便研究，根據PLC基因的種類和轉錄組基因ID的大小統一非洲菊PLC基因編號（GjNPC1～ GjNPC3，GjPLC1～GjPLC10）。

2.2 ?非洲菊PLC家族蛋白序列分析

通過PLC蛋白序列的理化性質分析（表2），發現非洲菊PLC蛋白序列的長度在98～594 aa之間，預測蛋白理論分子量為11 410.25～ 67 998.85 kDa，等電點為4.74～9.59。預測理論等電點小于7的酸性蛋白有7個，大于7的堿性蛋白有6個。所有蛋白的不穩定系數都大于40，表明它們均為不穩定蛋白;平均親水系數都為負值，表明他們均為親水蛋白。

通過在線軟件SOPMA分析預測非洲菊PLC蛋白序列的二級結構（表3），發現非洲菊PLC家族蛋白中無規則卷曲結構所占比例最高，除了GPLC1，β-轉角結構所占比例最低。在NPC中所有α-螺旋結構所占比例都高于延伸鏈結構，PI-PLC中則有7個α-螺旋結構所占比例高于延伸鏈結構。

通過在線軟件Plant-mPLoc Server分析預測非洲菊PLC蛋白序列的亞細胞定位（表3），發現13個非洲菊PLC蛋白在細胞壁、細胞膜、細胞質、葉綠體和細胞核中均有定位。其中，GjNPC1定位于細胞壁，GjNPC2、GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8定位于細胞膜，GjNPC3定位于細胞壁和葉綠體，GjPLC1與GjPLC9定位于細胞質，GjPLC2與GjPLC10定位于細胞膜和細胞核，GjPLC6定位于細胞膜和細胞質。

利用在線軟件MEME對非洲菊的PLC家族蛋白保守基序進行分析，本研究共預測分析了30個保守基序（圖1）。發現在13個非洲菊PLC蛋白序列中，motif4、motif9、motif13、motif1、motif17相連的基序可能為磷酸酯酶區，motif21、motif25、motif23、motif3、motif14、motif5、motif16和motif27、motif30、motif26相連的基序可能為X結構域，motif12、motif11、motif2、motif15相連的基序可能為Y結構域，motif8、motif10、motif6相連的基序可能為C2結構域。

上述結果表明，非洲菊PLC蛋白無論在理化性質、二級結構、還是亞細胞定位方面都有較大的差異，暗示非洲菊PLC基因具有不同生物學特征。

2.3 ?非洲菊PLC家族蛋白的進化分析

由圖2可知，13個非洲菊PLC蛋白成員可以分為GroupⅠ、GroupⅡ2個亞組，其中3個NPC蛋白分布在GroupI中，10個PI-PLC蛋白分布在GroupⅡ中。GroupⅡ分為a、b、c 3部分，GroupⅡa中有2個非洲菊PLC成員（GjPLC1、GjPLC9）和3個水稻PLC成員（OsPLC1、OsPLC2、OsPLC3）;GroupⅡb中有4個非洲菊PLC成員（GjPLC2、GjPLC5、GjPLC8、GjPLC10）、4個擬南芥PLC成員（AtPLC1、AtPLC2、AtPLC3、AtPLC7）和1個水稻PLC成員（OsPLC4）;Group IIc中有4個非洲菊PLC成員（GjPLC3、GjPLC4、GjPLC6、GjPLC7）和4個擬南芥PLC成員（AtPLC4、AtPLC5、AtPLC8、AtPLC9）。非洲菊PLC蛋白與雙子葉植物擬南芥在進化上親緣較關系較近，與單子葉植物水稻關系較遠，且進化關系較近的非洲菊PLC蛋白結構組成相似，可能具有相似的生物學功能。

2.4 ?非洲菊PLC家族蛋白互作分析

非洲菊PLC家族成員在擬南芥中的同源蛋白的互作關系預測分析顯示（表4、圖3），13個非洲菊PLC家族成員在擬南芥中同源性較高的蛋白有7個，分別為NPC1、NPC3、NPC6、PLC2、PLC4、AT2G40116、AT4G38690。其中，NPC1、NPC3、NPC6可以共存并相互結合，NPC1、PLC2可以共同表達，PLC2、PLC4、AT2G40116可以相互結合、催化并產生反應。表明擬南芥的PLC2、PLC4、AT2G40116蛋白家族成員可相互作用，而與其同源性較高的非洲菊蛋白家族成員GjPLC1、GjPLC2、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8、GjPLC9、GjPLC10是否可以相互作用還需進一步驗證。

2.5 ?非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中差異表達的FPKM值分析

從圖4可知，在非洲菊健康和感病植株中，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10的表達量較高，GjNPC1、GjNPC3、GjPLC1、GjPLC6、GjPLC7、GjPLC9表達量較低。與健康植株相比，GjNPC2、GjPLC1、GjPLC2、GjPLC6、GjPLC10在感病植株中上調，其中GjPLC2、GjPLC10上調量較高;GjNPC1、GjNPC3、GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC7、GjPLC8、GjPLC9在感病植株中下調，其中GjPLC3、GjPLC4、GjPLC5、GjPLC8下調量較高。GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10在非洲菊中表達量高，且與健康植株相比，感病植株中的表達量變化大，推測其在抵御真菌感染過程中發揮重要的生物學作用。

3 ?討論

3.1 ?非洲菊PLC基因家族成員多且可能具有不同的生物學功能

自1980年Irvine等[13]得到一種能分解磷脂酰肌醇的PLC后，水稻和擬南芥等模式植物中PLC相繼被人們克隆了出來，近年來隨著生物技術的發展，越來越多的PLC基因家族在多種不同的植物中被預測或鑒定出來，其中，擬南芥[14]中有14個（9個PI-PLC，5個NPC），水稻[15]中有9個（4個PI-PLC，5個NPC），棉花[16]中有15個（9個PI-PLC，6個NPC），亞麻芥[17]中有10個，玉米[18]中有9個、蓖麻[19]中有6個;楊樹[20]、蘭花[21]、桃[22]中只鑒定出PI-PLC，分別有7個、3個、5個。本研究基于實驗室課題組獲得的非洲菊轉錄組測序數據，鑒定出13個非洲菊PLC基因，其中NPC有3個，PI-PLC有10個。

本研究對非洲菊PLC蛋白序列的亞細胞定位分析，發現其在細胞壁、細胞膜、細胞質、葉綠體和細胞核中均有定位，且大部分位于細胞膜，這正好符合了Hong等[2]證實的大部分PLC定位在細胞膜上的結論。對非洲菊PLC家族的蛋白結構進行分析發現，NPC只包含一個磷酸酯酶區，PI-PLC則含有EF手型結構域、X結構域、Y結構域和C2結構域4個結構域，這與模式植物擬南芥[14]和水稻[15]的保守結構相同。對非洲菊分子進化樹分析，發現非洲菊PLC蛋白可分為2個大亞組，GroupⅠ為NPC，GroupⅡ為PI-PLC，其中GroupⅡ分為a、b、c 3個小亞組，進化關系較近的非洲菊PLC蛋白結構組成相似，可能具有相似的生物學功能。另外，對非洲菊PLC蛋白序列的分析，發現這13個蛋白在理化性質、二級結構等方面有較大的差異，表明非洲菊PLC基因可能具有不同生物學特性和功能。

3.2 ?非洲菊PLC基因家族可能參與植物免疫反應

越來越多的研究表明，磷脂酶C在植物先天免疫反應中起核心作用，可參與植物生物脅迫的適應過程[23]，例如水稻[24-25]中的OsPI-PLC1在病原菌脅迫下，可通過Ca2+信號通路參與植物抗病反應;擬南芥[26]感染病菌后AtPLC5蛋白可以參與信號脅迫傳導過程，增強抵御病原菌入侵能力;煙草[27]中的NtPLC4過量表達后，煙草植株抗病性顯著提高等。本研究利用非洲菊轉錄組測序數據中的FPKM值，分析非洲菊PLC基因家族在健康和感病植株中的差異表達發現，與健康植株相比，感病植株中有5個基因上調，8個基因下調。其中，GjPLC2、GjPLC3、GjPLC8、GjPLC10的表達量高，表達量變化大，推測其在抵御真菌感染過程中發揮重要的生物學作用。

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責任編輯：白 ?凈