荔枝LcMYB1異源表達促進矮牽牛和番茄花色苷的積累

杜麗娜 陳春帆 蘇睿 譚春艷 賴彪

摘 ?要：為分析荔枝LcMYB1的功能，以白色‘W115矮牽牛和‘Micro-Tom番茄為材料，利用農桿菌介導法將LcMYB1在矮牽牛和番茄中異源表達，觀測轉基因植株表型。結果表明：與‘W115相比，轉基因矮牽牛的葉片和花瓣中積累了花色苷，且矮牽牛花色苷生物合成結構基因PhCHS和PhDFR、調控基因PhAN1的表達顯著上調;與野生型‘Micro-Tom番茄相比，轉基因番茄的葉片和花藥中積累了花色苷，且相應組織花色苷生物合成結構基因SlDFR、調控基因SlAN1和SlJAF13的表達顯著上調，雖然果實中沒有積累花色苷，但SlAN1和SlJAF13表達也顯著上調。LcMYB1在矮牽牛和番茄中異源表達時通過上調花色苷生物合成關鍵結構基因和調控基因bHLH的表達誘導花色苷積累。因此，荔枝LcMYB1是花色苷生物合成中的關鍵轉錄因子，具備異源轉化利用的潛力。

關鍵詞：LcMYB1;矮牽牛;番茄;花色苷

中圖分類號：S667.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： In order to better understand the function of LcMYB1 and provide theoretical support for further utilization， LcMYB1 was transformed into both petunia and tomato. White flower ‘W115 petunia and ‘Micro-Tom tomato were used as materials in LcMYB1 ectopic expressed assays. Anthocyanin contents and related gene expressions were ana-lyzed in transgenic plants. Ectopic expression of LcMYB1 in ‘W115 resulted in anthocyanin production in vegetative and floral tissues such as leaves and petals， probably by transcriptional activation of anthocyanin biosynthetic genes such as PhCHS and PhDFR and endogenous anthocyanin regulatory gene PhAN1. However， the transgenic tomato only produced anthocyanin in anthers and leaves but not in tomato fruits and petals. The results suggested that LcMYB1 could enhance anthocyanin production in vegetative and floral tissues of both petunia and tomato by activating anthocyanin biosynthesis and regulatory genes. LcMYB1 is an important transcriptional regulatory factor in anthocyanin biosynthesis of plants and is potentially used in ectopic transformation.

Keywords： LcMYB1; petunia; tomato; anthocyanin

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.013

色澤是花卉和果蔬的重要品質組成之一。花色苷是植物組織或器官呈現出粉色、紅色、紫色甚至黑色的重要次生代謝成分之一。花色苷除了能給蔬菜、花卉、水果帶來鮮艷的顏色，還具有對生物和非生物脅迫給植物帶來傷害的保護作用，比如：紫外線照射、冷脅迫、干旱脅迫等[1-3]。大量研究表明，花色苷合成代謝的調控主要在轉錄水平上[4]。轉錄因子R2R3-MYB、bHLH（basic Hlix-Loop-Hlix）和WD40相互作用形成MBW蛋白復合體，通過調控花色苷合成代謝的結構基因表達來調控植物花色苷的生物合成[5]。

蘋果（Malus domestica）中有2個MYB轉錄因子調控果實花色苷的生物合成，其中MdMYB1主要調控光依賴的果皮著色[6]，而MdMYB10主要調控果肉的花色苷積累[7]。此外，在梨（Pyrus pyrifolia）[8]、山竹（Garcinia mangostana）[9]、楊梅（Myrica rubra）[10]等水果中也克隆到了調控果實花色苷生物合成的關鍵MYB類轉錄因子。這些花色苷生物合成的關鍵調控基因的發現為果實的遺傳改良提供重要的基因資源。

荔枝（Litchi chinensis）是我國南方重要的熱帶亞熱帶果樹，種質資源豐富，果實色澤類型多樣。荔枝果皮的紅色是花色苷積累的結果，前期利用同源序列方法克隆了荔枝LcMYB1，并在煙草中超表達LcMYB1誘導了葉片和花瓣花色苷的積累[11]。本文將該基因在‘W115矮牽牛和‘Micro-tom番茄中超表達，進一步研究LcMYB1的功能，為該基因作為基因工程育種的候選基因提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實驗所用的‘Micro-Tom番茄、‘W115矮牽牛（MYB轉錄因子PhAN2和PhAN4雙突變體）和根癌農桿菌菌株AGL0由阿姆斯特丹大學Francesca M Quattrocchio和Ronald Koes研究小組饋贈。pBI121-LcMYB1（圖1）質粒由本實驗室保存。

1.2 ?‘W115矮牽牛的遺傳轉化

取溫室生長狀態良好的‘W115植株葉片，表面消毒（70%酒精清洗30 s，10%次氯酸清洗10 min，然后用無菌水清洗4～5次），用無菌手術刀在超凈工作臺內將準備好的葉片切成1 cm× 1 cm的小方塊，放入準備好的OD600為0.1的農桿菌中侵染10 min。將侵染后的外植體取出，用滅菌濾紙吸收多余的農桿菌后放入共培養培養基（1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L玉米素+2.0%蔗糖+1%葡萄糖）中。于25 ℃共培養2 d后將外植體轉移到篩選培養基（1/2 MS+ 2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L玉米素+ 2%蔗糖+1%葡萄糖+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中，待出芽后將芽切下轉移到生根培養基（1/2 MS+2%蔗糖+1%葡萄糖+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中培養生根。

1.3 ?‘Micro-Tom番茄的遺傳轉化

取適量的‘Micro-Tom種子進行表面消毒（70%酒精清洗2 min，10%次氯酸清洗10 min，然后用無菌水清洗4～5次），將消毒的種子播種于MS培養基中，待種子發芽長出葉子備用（大約10 d左右）。將一片子葉切成2段后轉移到準備好的農桿菌中侵染10 min，將侵染后的外植體取出，用滅菌濾紙吸收多余的農桿菌后放入共培養培養基（1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.4 mg/L玉米素+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES）中。于25 ℃共培養2 d后將外植體轉移到篩選培養基（1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.4 mg/L玉米素+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中，待出芽后將芽切下轉移到生根培養基（1/2 MS+2%葡萄糖+1.0 mmol/L MES+250 mg/L頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素）中培養生根。

1.4 ?花色苷含量測定

參照Wrolstad等[12]的方法，采用pH示差法測定矮牽牛和番茄各組織器官的花色苷含量，具體步驟為：分別取各組織0.1 g樣品于3 mL浸提液（甲醇∶水∶濃鹽酸=85∶12∶3）中，室溫避光充分浸提（約5～6 h）。Buffer 1：0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl（25∶67），pH=1;Buffer 2：1 mol/L NaAc-0.4 mol/L HCl（100∶150），pH 5。取0.5 mL浸提液分別加入2支試管中，然后分別加入2 mL的Buffer 1和Buffer 2，用紫外分光光度計分別測定530 nm吸光值。

根據經驗公式計算結果，花色苷含量（mg/g）= ?;其中5為稀釋倍數，3為提取液體積（mL），445.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，29600為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數，0.1表示樣品質量（g）。

1.5 ?RNA的提取與cDNA合成

使用Magen公司的Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒（具體方法參照說明書）進行矮牽牛和番茄各組織器官樣品RNA的提取。使用DNase I（TaKaRa）消化RNA中殘留的DNA（具體方法參照說明書）。RNA的濃度測定和純度分析：取1 L RNA溶液稀釋至100 L，置于紫外核酸蛋白檢測儀上分別測定260、280和320 nm吸光值并計算OD260/OD280值。當OD260/OD280值介于1.80～2.00之間時，RNA樣品用于下一步試驗。總RNA樣品濃度按下列公式計算：RNA（ng/L）=OD260× 40 ng/L×100。為進一步評價總RNA的完整性，取2～3 L總RNA進行1.2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總RNA作為模板合成第一鏈cDNA，反轉錄采用TaKaRa的SuperScript One- Step RT-PCR System試劑盒，引物為Oligo（dT）15（Ta?KaRa）。cDNA的合成參照反轉錄酶說明書進行。

1.6 ?熒光定量PCR

Real-time PCR反應在ABI QuantStudio 3 Real-time PCR System上進行，引物見表1。反應條件如下：95 ℃ 15 s;56 ℃ 15 s;72 ℃ 35 s;40個循環。熔解曲線分析參考Wei等[13]的方法。運用2?ΔΔCT法進行數據處理[14]，計算出花色苷生物合成相關基因在不同樣品中的表達水平。以上所有實驗均設3次重復，每次實驗以ddH2O為陰性對照。矮牽牛和番茄的內參基因分別為PhEF1Α和Sl18SrRNA。

2 ?結果與分析

2.1 ?轉LcMYB1基因矮牽牛表型觀測

研究中使用的白色‘W115矮牽牛是花色苷合成調控的關鍵MYB轉錄因子PhAN2和PhAN4的雙突變體，可避免矮牽牛自身MYB轉錄因子對顏色形成的干擾。將重組質粒pBI121-LcMYB1轉化農桿菌AGL0中后，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將LcMYB1轉入白色‘W115矮牽牛中。與對照相比，轉基因矮牽牛的葉片變紅，花瓣變為淺紫色（圖2A～圖2D）。LcMYB1超表達的葉子和花瓣均顯著積累花色苷，葉片中花色苷含量為0.02 mg/g，花瓣中花色苷含量為0.12 mg/g（圖2E）。說明LcMYB1異源表達可以誘導矮牽牛葉片和花瓣花色苷積累，一定程度上彌補了PhAN2和PhAN4的缺失。

2.2 ?轉LcMYB1基因矮牽牛花色苷生物合成相關基因的表達

為進一步分析LcMYB誘導矮牽牛花色苷的積累機理，利用熒光定量PCR檢測了LcMYB1、花色苷生物合成關鍵結構基因PhCHS、PhDFR和bHLH調控基因PhAN1在對照和轉基因植株中的表達情況。結果表明，LcMYB1在對照植株花瓣和葉片中均無表達，在轉基因的矮牽牛花瓣和葉片中均表達，且在葉片中的表達量更高，說明LcMYB1已成功轉入到‘W115中（圖3）。PhCHS在轉基因矮牽牛葉片中的表達水平比對照增加1倍，在花瓣中的表達明顯被激活。PhDFR在對照的葉片和花瓣中均無表達，而轉基因植株中其表達顯著被激活，且在葉片中的表達高于花瓣。在對照中，PhAN1在葉片中無表達，在花瓣中有一定的表達，在轉基因植株葉片中PhAN1的表達顯著被激活，花瓣中PhAN1有一定提高，但不顯著。

因此，LcMYB1可能通過上調矮牽牛PhCHS、PhDFR和PhAN1的表達誘導花色苷的積累。

2.3 ?轉LcMYB1基因番茄表型觀察

利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將LcMYB1轉入‘Micro-Tom番茄中。與對照相比，轉基因番茄的葉片變紅，花藥也由黃色變成了紅色（圖4A～圖4D）。通過測定分析花色苷含量發現，對照植株除葉片有少量花色苷積累外，果實、花藥、花瓣均無花色苷積累，而轉基因植株的葉片和花藥中積累了花色苷，含量分別為0.24 mg/g和0.10 mg/g，其花瓣和果實中均未檢測到花色苷（圖4E）。

2.4 ?轉LcMYB1基因番茄花色苷生物合成相關基因的表達

同樣，利用熒光定量PCR檢測了轉基因番茄中LcMYB1、SlDFR和花色苷生物合成關鍵bHLH調控基因SlAN1和SlJAF13的表達情況。由圖5分析發現，LcMYB1在轉基因番茄的葉片和花藥中表達較高，果實中表達相對較低，而在對照植株的各個器官均無表達，說明LcMYB1已成功轉入到‘Micro-Tom番茄中。與在矮牽牛中LcMYB1的表達模式類似，LcMYB1在各個組織中的表達有較大差異。SlDFR和SlAN1的表達模式相似，SlDFR和SlAN1在對照植株的葉片、果實和花藥中均有較低或無表達，而在轉基因植株的葉片和花藥中其表達顯著被激活，在果實中的表達量均較低。SlDFR和SlAN1的基因表達水平與番茄的花色苷含量一致。SlJAF13在對照植株葉片、果實和花藥中均有一定表達，在轉基因植株中該基因在各組織的表達水平均提高了約1倍。

3 ?討論

本研究組前期研究發現荔枝LcMYB1在各個組織器官中的表達水平與花色苷含量呈正相關，并通過煙草異源表達確定LcMYB1是調控荔枝中花色苷生物合成的關鍵轉錄因子[11]。本研究分別在白色‘W115矮牽牛和‘Micro-Tom番茄中超表達LcMYB1，結果顯示，轉基因矮牽牛可以在葉片和花瓣中積累花色苷，轉基因番茄的葉片和花藥積累了大量花色苷。‘W115為矮牽牛花色苷生物合成關鍵MYB調控基因PhAN2和PhAN4雙突變植株，花瓣為白色[15]，因此，利用‘W115研究LcMYB1的功能可以避免內源MYB基因的影響。此外，荔枝LcMYB1無論是通過瞬時表達還是穩定遺傳轉化均可誘導煙草花色苷積累[11]，這表明荔枝LcMYB1在煙草、番茄和矮牽牛中均有較強的誘導花色苷生物合成的能力。

MYB轉錄因子調控花色苷生物合成的機理是MYB轉錄因子結合到花色苷生物合成途徑中的結構基因的啟動子上，調節這些結構基因的表達[4]。在植物積累花色苷的過程中，MYB轉錄因子和結構基因的表達模式和花色苷的積累量一致。在楊梅果實發育過程中，MrF3H、MrF3H、MrDFR1、MrUFGT和MrMYB1的表達水平與楊梅果實的花色苷含量正相關[10]。在蘋果不同著色程度的果皮中，MdANS、MdUFGT和MdMYB1的表達水平也與果實的著色程度高度一致[6]。與對照相比，矮牽牛花色苷生物合成關鍵調控基因PhAN1、結構基因PhCHS和PhDFR在轉基因植株中均表達上調，而轉基因番茄的葉片、果實和花藥中花色苷生物合成的關鍵調控基因SlAN1、SlJAF13、結構基因SlDFR的表達上調。綜合前期研究發現，LcMYB1轉錄因子可以在不同植物中（包括煙草、矮牽牛和番茄）通過調控花色苷生物合成的結構基因和調控基因來促進或誘導花色苷的積累。

近期研究發現，番茄SlMYB75可以誘導‘Micro-Tom番茄葉片、花藥和果實積累大量花色苷，與SlMYB75相比，LcMYB1可以誘導番茄葉片和花藥的花色苷生物合成，但并不能誘導番茄果實積累花色苷，推測可能是由于番茄果實中抑制花色苷生物合成的R3-MYB轉錄因子SlMYBATV的表達與LcMYB1競爭bHLH，從而抑制花色苷的合成，導致無法啟動果實中花色苷生物合成的關鍵結構基因[16-17]。前人將調控玉米花色苷生物合成的Lc（MYB）和C1（bHLH）同時轉化到番茄中，無法誘導番茄果實花色苷的合成[17]。而在番茄中同時超表達來自金魚草的Del（bHLH）和Ros1（MYB），則可以誘導番茄果實合成大量的花色苷[18]。這表明，不同植物來源的MYB轉錄因子在同一植物異源表達時會出現不同表型。

綜上所述，本研究證實了在矮牽牛和番茄中LcMYB1通過上調花色苷生物合成關鍵結構基因和bHLH調控基因的表達來調控花色苷生物合成的功能，同時也發現LcMYB1轉錄因子在不同植物上異源表達的表型有一定的差異，不能誘導植物的所有器官積累花色苷，這些結果可為利用基因工程育種在基因選擇上提供參考。

參考文獻

[1] Ubi B E， Honda C， Bessho H， et al. Expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in apple skin： Effect of UV-B and temperature[J]. Plant Science， 2005， 170（3）： 571-578.

[2] Castellarin S D， Pfeiffer A， Sivilotti P， et al. Transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in ripening fruits of grapevine under seasonal water deficit[J]. Plant， Cell & En-viron， 2007， 30（11）： 1381-1399.

[3] Zhang Y， Zheng S， Liu Z， et al. Both HY5 and HYH are necessary regulators for low temperature-induced anthocyanin accumulation in Arabidopsis seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（4）： 367-374.

[4] Allan A C， Hellens R P， Laing W A. MYB transcription factors that colour our fruit[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（3）： 99-102.

[5] Xu W， Dubos C， Lepiniec L. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYB-bHLH-WDR complexes[J]. Trends in Plant Science， 2015， 20（3）： 176-185.

[6] Takos A M， Jaffe f W， Jacob S R， et al. Light-induced ex-pression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples[J]. Plant Physiology， 2006， 142（3）： 1216-1232.

[7] Espley R V， Hellens R P， Putterill J， et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor， MdMYB10[J]. Plant Journal， 2007， 49（3）： 414-427.

[8] Feng S， Wang Y， Yang S， et al. Anthocyanin biosynthesis in pears is regulated by a R2R3-MYB transcription factor Py-MYB10[J]. Planta， 2010， 232（1）： 245-255.

[9] Palapol Y， Ketsa S， Lin-Wang K， et al. A MYB transcription factor regulates anthocyanin biosynthesis in mangosteen （Garcinia mangostana L.） fruit during ripening[J]. Planta， 2009， 229（6）： 1323-1334.

[10] Niu S S， Xu C J， Zhang W S， et al. Coordinated regulation of anthocyanin biosynthesis in Chinese bayberry （Myrica rubra） fruit by a R2R3 MYB transcription factor[J]. Planta， 2010， 231（4）： 887-899.

[11] Lai B， Li X J， Hu B， et al. LcMYB1 is a key determinant of differential anthocyanin accumulation among genotypes， tissues， developmental phases and ABA and light stimuli in Litchi chinensis[J]. PLoS One， 2014， 9（1）： e86293.

[12] Wrolstad R E， Culbertson J D， Cornwell C J， et al. Detection of adulteration in blackberry juice concentrates and wines[J]. Journal - Association of Official Analytical Chem-ists， 1982， 65（6）： 1417-1423.

[13] Wei Y Z， Hu F C， Hu G B， et al. Differential expression of anthocyanin biosynthetic genes in relation to anthocyanin accumulation in the pericarp of Litchi chinensis Sonn[J]. PLoS One， 2011， 6（4）： e19455.

[14] Schmittgen T D， Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T） method[J]. Nature Protocols， 2008， 3（6）： 1101-1108.

[15] Quattrocchio F， Wing J， Van Der Wouder K， et al. Mo-lecular analysis of the anthocyanin2 gene of petunia and its role in the evolution of flower color[J]. Plant Cell， 1999， 11（8）： 1433-1444.

[16] Jian W， Cao H， Yuan S， et al. SlMYB75， an MYB-type

transcription factor， promotes anthocyanin accumulation and enhances volatile aroma production in tomato fruits[J]. Horticulture Research， 2019， 6（1）： 22.

[17] Sun C， Deng L， Du M， et al. A transcriptional network pro-motes anthocyanin biosynthesis in tomato flesh[J]. Molecular Plant， 2020， 13（1）： 42-58.

[18] Bovy A， De Vos R， Kemper M， et al. High-flavonol toma-toes resulting from the heterologous expression of the maize transcription factor genes LC and C1[J]. Plant Cell， 2002， 14（10）： 2509-2526.

[19] Butelli E， Titta L， Giorgio M， et al. Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors[J]. Nature Biotechnology， 2008， 26（11）： 1301-1308.

責任編輯：謝龍蓮