錦鯉昏睡病(KSD)的實驗室診斷分析(下)

劉 群，王 菁，劉桐山，王 鋼，韓進剛，馮守明

(1.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402；2.天津市水產研究所，天津 300221)

4.寄生蟲檢測和細菌分離結果

經制片和顯微觀察，所檢錦鯉病魚組織均未觀察到寄生蟲。將病魚腦、肝胰臟、脾、腎組織病料接種于LB平板上，28℃培養24小時，未見細菌生長。

5.分子生物學檢測結果

采用相關檢測方法對2018年7月末采集的患病錦鯉鰓組織樣品進行SVCV、KHV、CyHV-II、CEV分子生物學檢測，結果顯示，發病錦鯉鰓組織樣品均未擴增出SVCV、KHV、CyHV-II特異性片段(未列出)；CEV TaqMan熒光定量檢測方法結果如圖4A，顯示該樣品Ct值小于35，CEV為陽性。

6.人工感染試驗結果

養殖水溫為(25±2)℃時，由患病錦鯉鰓組織制備組織懸液腹腔注射感染健康錦鯉，并依據《鯉浮腫病診斷規程》(SC/T 7229－2019)中的檢測方法對注射組、對照組錦鯉鰓組織進行CEV TaqMan熒光定量PCR檢測，結果如圖4B所示。人工感染試驗結果顯示，注射組死亡錦鯉未呈現CEV典型癥狀，統計錦鯉累積死亡率，其累積死亡率為(65±7.07)%，半數致死時間(LT50)為16天；對照組累積死亡率為(15±7.07)%(圖5)。CEV Taq-Man熒光定量PCR檢測結果顯示，注射組20尾錦鯉中有14尾為CEV陽性，其陽性檢出率為70%，對照組未檢出CEV。

圖4 錦鯉鰓組織樣品CEV TaqMan熒光定量PCR擴增曲線

圖5 人工感染試驗中累積死亡率與注射時間關系

三、討論

本研究根據天津市北辰區某錦鯉養殖場患病錦鯉流行病學調查及病理學、寄生蟲學、細菌學、病毒學鑒定結果，確定2018年夏季引起該養殖場錦鯉暴發性死亡的原因為錦鯉睡眠病(KSD)，其病原為鯉浮腫病毒(CEV)。

從臨床癥狀上看，病魚常聚集于水面或池塘邊緣，或靜置于池中倒向一側，呈昏睡狀態。受觸動時會游動，但很快處于昏睡狀態。大多表現出爛鰓、體表糜爛、出血、皮下組織水腫、眼球凹陷、食欲不振、吻端和鰭基部潰瘍等臨床特征(Adamek M等，2017；呂曉楠等，2018)。本研究中感染KSD錦鯉表現出與之相似的臨床表觀特征，不同的是筆者所解剖錦鯉未觀察到體表糜爛、出血、皮下組織水腫、吻端和鰭基部潰瘍病變特征。針對人工感染試驗后出現的臨床癥狀也有不同報道，Oyamatsu T等(1997b)、Miyazaki T等(2005)和劉群等(2018)通過人工感染方式回接健康鯉，導致實驗魚部分出現與自然發病魚相似癥狀而死亡；Adamek M等(2016)、Matras M等(2016)和王小亮等(2017)研究發現部分實驗魚感染CEV，但未呈現典型癥狀和大量死亡現象。本研究人工感染試驗可致70%錦鯉感染CEV，且(65±7.07)%出現死亡，但未表現出典型臨床癥狀。由此推測，鯉感染CEV出現KSD典型臨床癥狀和大量死亡可能由其他因素引起，仍需深入研究。

從組織病理結果上看，包括爛鰓在內的鰓絲損傷是受感染錦鯉最常見的癥狀。低倍鏡觀察到鰓組織上皮細胞過度增殖導致鰓絲腫脹；高倍鏡下顯示鰓細胞水腫、重度增生，鰓小片有融合及上皮細胞脫落(Lewisch E等，2015；Adamek M，2017；Ono S I，1986)。本研究顯示患病錦鯉鰓組織為主要病變組織，其病理特征與Lewisch E等(2015)、Ono S I(1986)、Oyamatsu T等(1997b)的研究結果相似。此外，患KSD的錦鯉肝胰臟、腎臟和脾臟也都發生不同程度病變，出現細胞廣泛水腫，可見疑似包涵體、炎癥細胞浸潤等較嚴重病理變化，而其腦組織整體結構正常，未見明顯病理變化。Oyamatsu T等(1997b)認為CEV感染鯉引起的鰓損傷導致患病魚鰓組織和內臟組織呈現病理變化。由此推測，引起KSD的致病原侵染魚體后在最易受寄生蟲或水質影響而被破壞的鰓組織內增殖，使鰓絲末端細胞增生，并隨血液進入體內組織，從可能影響血液氣體交換發展到體內組織發生變質性炎癥，導致魚出現缺氧、浮頭、反應遲緩，致使魚體呼吸及滲透壓調節發生障礙，肝胰臟、腎、脾等重要器官正常的生理代謝功能受到損害，終至死亡。

國外現有研究表明痘病毒科種類傳播主要方式是經皮膚傷口感染，并在鰓組織中觀察到病毒粒子，認為鰓是CEV在魚體內引起典型病變的主要部 位(Jung S V，2015；Rajaswaminathan T，2016；Ono S I，1986)。國內現有研究已在腎組織中觀察到形態類似痘病毒顆粒(徐立蒲等，2017)，表明其可在腎組織中增殖富集。本次實驗室診斷在發病魚脾組織中觀測到大量病毒樣顆粒，表明除鰓、腎組織外，CEV也可在脾組織增殖，提示做病原檢測等研究時，可取鰓、腎、脾組織；而電鏡觀測病毒方法雖直觀有效，但其制備過程較復雜，周期較長，多用于科研，不適用于臨床檢測工作。

通常認為水溫是發生CED、KSD的環境誘因。Miyazaki T等(2005)認為水溫是影響CEV的重要環境因子。研究發現，較低水溫(6～10℃)時，錦鯉感染CEV病程較長，死亡率較低；15～25℃時，幼魚累積死亡率高達75%～100%；較高溫度時，實驗魚最初僅昏睡，2～3天大量死亡。有調查研究發現，該病在我國河南等地有兩個發病高峰時間，即5－6月和9月(呂曉楠等，2018)。這兩個時間段的水溫一般維持在20～27℃。本研究進行的人工感染試驗可導致錦鯉累積死亡率達到(65±7.07)%，表明在(25±2)℃下CEV可致錦鯉出現大量死亡。據此推測CEV在我國傳播最適水溫可能是20～27℃。同時，綜合現有資料，CEV可在較寬溫度范圍內(6～27℃)被檢出，提示該病暴發可能是包括溫度在內的其他因素共同作用的結果。

針對KSD防控方面，Miyazaki T等(2005)、Seno R等(2003)研究指出，將發病魚從飼養池取出，當水溫升到20～25℃時，使用6‰～7‰鹽水加抗生素持續進行藥浴10～14天，對防控此病有顯著效果。另外，進入越冬池時，可以使用6‰～7‰鹽水浴并升溫，之后逐漸添加少量新水以沖淡鹽水，可預防此病。但是體形較小幼魚較難恢復，通常多在采卵時采取凈化措施預防。使用此種方式能夠抑制病原體黏附宿主，提高魚體免疫力，幫助維持魚體滲透壓，有助于降低該疫病發生時魚體死亡率，但是治愈后的魚仍可能具有傳染性，并不能從根本上殺死或消滅病毒。

本研究綜合應用流行病學調查、病理學、寄生蟲學、細菌學方法，并依據針對病毒P4a基因設計的熒光定量PCR檢測方法將導致此次錦鯉暴發性死亡的致病原鑒定為CEV。值得注意的是，該養殖場此前未曾暴發過KSD。推測該養殖場可能存在其他途徑的病原傳入風險，仍有待進一步調查以證實。因此，在生產中要嚴格執行消毒和隔離制度，通過檢測、檢疫防止病原侵入，采取生物安保措施防范KSD的發生和蔓延。

(全文完)