一株諾卡氏菌的分離鑒定、藥敏試驗及治療方案探討

王友娟，徐 祥，尹懷磊，李 華，夏 偉，張 浩，冷敦鵬

(1.青島中仁動物藥品有限公司，山東 青島 266329；2.膠州市農業農村局，山東 青島 266329)

目前我國水產動物結節病的發生呈逐年上升趨勢，對烏鱧(Snakehead)、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)、羅非魚(Tilapiamossambica)、高體(Serioladumerili)、鱸等經濟魚類造成巨大危害(范寧寧，2018)。其中引起烏鱧類結節病的病原有諾卡氏菌、舒氏氣單胞菌、類立克次氏體和分枝桿菌等(唐國盤，1982)。對水產動物結節病病原及其藥物敏感性的研究，有利于水產科研工作者和一線養殖者了解掌握疾病的發生規律，從而為疫病的防控提供依據，為藥物的合理使用提供參考。

2020年11月安丘市坊子區劉姓養殖戶池塘飼養的烏鱧發生間斷死亡，病魚可見體色偏黑、反應遲鈍、乏力、浮游于水面，體表有損傷并潰爛出血，嚴重者鱗片脫落、潰爛并形成較大的膿腫。為了盡快弄清病因，找到有效可行的防治方法，筆者對其病原及防治藥物進行了研究，現將結果報告如下。

一、材料與方法

1.試驗材料

(1)病魚來源：病魚于2020年11月采自安丘市，體長30～35厘米，個體重2～2.5千克。

(2)試劑耗材：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自國藥集團化學試劑有限公司，110毫米直徑定性濾紙購自杭州新華紙業有限公司，10%鹽酸多西環素可溶性粉、5%硫酸新霉素粉、10%氟苯尼考可溶性粉、5%恩諾沙星粉、10%磺胺間甲氧嘧啶鈉粉及30%阿莫西林可溶性粉由青島中仁動物藥品有限公司生產。

(3)主要儀器設備：震蕩培養箱(HZQ-F160)、恒溫培養箱(DHP-9052)和細菌濁度儀(WGZ-XT)。

2.試驗方法

(1)臨床癥狀及剖檢：首先調查發病池塘水溫、病魚的魚齡、苗種來源、病魚在養殖池中的活動情況、死亡率等，并在現場進行解剖和觀察，記錄病魚體外和體內的臨床癥狀。

(2)寄生蟲檢查：分別取少量魚體表黏液及鰓絲于載玻片上，加1滴無菌生理鹽水，展開后用顯微鏡進行鏡檢。

(3)病原菌分離、鑒定：在無菌條件下，分別從病魚的肝臟、腎臟組織中接菌，于TSA培養基上28℃恒溫培養5～7天，挑取形態特征一致的優勢菌落在TSA平板上多次劃線純化，直至得到形態一致、特征穩定的菌落，將純分離物平板送至華大基因科技服務有限公司進行分子鑒定和測序。

(4)藥敏紙片制作：為了節約藥敏試驗成本，藥敏紙片自制，方法參照張浩(2018)和王傳峰(2015)等的方法。利用打孔器將110毫米的定性濾紙打成直徑為6毫米的圓形小紙片，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮紙包好瓶口并用小線扎緊，高壓滅菌(121℃，15分鐘)，烘干，密封備用。抗菌藥物的濃度統一選擇100毫克/升，配置好后過濾除菌，然后吸取無菌藥液1毫升加入裝有紙片的青霉素瓶中，用牛皮紙密封瓶口，浸泡1小時，讓藥液被紙片充分吸凈，空白對照采用無菌雙蒸水按照同樣方法制得；然后將紙片散開放入滅菌的培養皿中，無菌室擱置過夜，待紙片完全干燥后，收集在青霉素瓶內，密封，貼好標簽，置于-20℃保存備用。

(5)藥敏試驗：藥物敏感性試驗采用紙片瓊脂擴散法，參照何晟毓(2020)的方法并略有改動。將分離純化的病原菌接種于TSA液體培養基，28℃恒溫搖床震蕩培養4～7天，將菌液用微量電動組織混勻器充分混勻后吸取200微升，參照麥氏比濁管調整菌液濃度為1.8×108CFU/毫升，在無菌環境下均勻涂布于整個平板。待培養基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養基表面，28℃恒溫箱中培養3～7天，使用游標卡尺測量、記錄抑菌圈直徑大小，根據抑菌圈直徑大小粗略判斷同等濃度下不同藥物的敏感性。

二、結果

1.臨床癥狀及剖檢結果

病魚體表呈現斑點狀潰瘍、膿瘡或出血，部分病魚眼睛外凸，腹部異常腫大，解剖可見大量血性腹水，脾臟、腎臟、肝臟內外布滿直徑2～5毫米的黃白色結節，尤以腎臟最為嚴重，在后腎處形成巨大的囊腫物，部分病魚按壓皮膚會流出膿血(圖1)。鏡檢未見寄生蟲感染。

圖1 病魚體外和體內臨床癥狀

2.細菌分離

將劃線接種的TSA平板經28℃恒溫培養4天后才有少許菌落生長。從患病烏鱧肝臟、腎臟、脾臟均分離得到同一種形態的優勢菌，呈淡黃色沙粒狀，菌落呈不規則凸起(圖2)。將其命名為菌株ZRWL-16。

圖2 分離菌在TSA培養基上的菌落形態

3.菌種鑒定結果

NCBI-BLAST比對顯示，該株分離菌與Nocar-diaseriolaeUTF1(登錄號為AP017900.1)序列相似性為99.72%，最終鑒定ZRWL-16菌株為諾卡氏菌。

4.藥敏試驗

分離菌ZRWL-16在TSA瓊脂上生長良好，28℃培養96小時后能清楚判斷抑菌圈大小(圖3)。

圖3 藥敏試驗結果

同等濃度下，該株諾卡氏菌對藥物的敏感性從高到低依次為10%鹽酸多西環素可溶性粉、10%氟苯尼考可溶性粉、10%磺胺間甲氧嘧啶鈉、5%恩諾沙星和5%硫酸新霉素，抑菌圈直徑分別為20.35、18.60、16.52、15.25、13.20毫米。

5.治療方案

確診為諾卡氏菌感染后，筆者推薦養殖戶使用內服加外消的方法(抗菌＋提高免疫力＋修復肝臟損傷)進行治療。建議先給烏鱧減料，使用聚維酮碘溶液對水體進行消毒，用量按說明書所示，隔1天用1次，進行1～2次，同時拌料內服“鹽酸多西環素(或氟苯尼考)＋黃芪多糖＋肝膽康泰”，用量按具體產品說明，連續投喂7天，每天投喂1餐，并結合使用過硫酸氫鉀產品連續改底兩次。劉老板按照這個方案使用了5天，死魚明顯減少，8天后只有零星死亡，病情基本得到了控制。

三、討論

由于諾卡氏菌為革蘭氏陽性菌，臨床上對革蘭氏陽性菌敏感的藥物不多，且該菌生長緩慢，潛伏期長，易在體內形成結節，導致治療難度大(何晟毓等，2020；胡雄等，2019)。目前對該病的防治依賴于抗菌藥物，根據本試驗結果，該病病原對鹽酸多西環素、氟苯尼考等較敏感。但在不同地域、不同養殖品種、不同養殖管理模式下，病原的藥物敏感譜會有所不同。耐藥性的增加和藥物本身的副作用可能會導致養殖動物肝腎損傷，因此建議在選擇敏感藥物進行治療的同時，搭配可以促進肝臟分泌膽汁、增強肝臟解毒和排毒功能的膽汁酸，或具有保肝護肝、調節免疫力、清熱解毒的中草藥提取物及消除應激的維生素等。最后，也是最重要的一條，一定要增強病害防控意識，做到“預防為主、防重于治”，并對癥用藥。