乳腺癌超聲征象與腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平的相關性

張海見，米拉·也爾蘭，冷曉玲

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院超聲診斷科，新疆 烏魯木齊830000

乳腺癌是全世界女性中發病率最高的癌癥［1］。90%的乳腺癌患者死亡并非由原發腫瘤引起，而是由于原發腫瘤的遠處轉移，目前轉移性乳腺癌患者的生存率仍無顯著提高［2］。上皮細胞的無限增殖和新血管生成被認為是促進腫瘤細胞發生轉移的要基礎［3-4］，但上皮細胞如何獲得轉移的能力目前還不十分清楚。

在一定的生理或病理條件下，上皮細胞會暫時失去極性，出現間質細胞的特征，即上皮細胞黏附能力下降、細胞極性喪失、細胞拉長等間質表型特征［5］。理論上細胞的這些轉化會改變乳腺癌的組織骨架，并影響超聲下的表現。此外，有學者發現乳腺癌細胞通過上皮-間質轉化（EMT）獲得轉移遷移能力，侵犯骨組織，形成轉移性骨腫瘤［6］；有學者通過完全源自誘導經歷EMT乳腺癌細胞，再分析其腋窩淋巴結的轉移情況，以評估其轉移潛能［7］。研究顯示，EMT與乳腺癌的侵襲轉移顯著相關，乳腺癌細胞通過EMT獲得轉移遷移能力，侵襲周圍或遠處組織，成為轉移性腫瘤。但目前通過分析乳腺癌超聲征象與EMT之間關系進而預測乳腺癌侵襲轉移風險的研究還十分罕見。分子影像學技術的迅速發展為研究提供了可能。近年來，EMT 所涉及的分子機制的研究已經取得實質性進展：EMT經典標志物［波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌動蛋白、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)］的上調以及細胞外基質蛋白（層粘連蛋白和肌成束蛋白）的過表達以及特征性上皮標志物E-鈣黏蛋白(Ecadherin)的表達減少都優先發生在具有“基底樣表型”的乳腺腫瘤中［8-9］。這些EMT相關標志物的發現成為了研究乳腺癌超聲征象與EMT關系的橋梁。本研究旨在探討腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物在不同乳腺癌超聲征象下表達水平的差異性，進而預測乳腺癌潛在的侵襲和轉移能力，并有可能為臨床醫生在術前選擇化療方案和治療手段時提供指導依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016～2018年在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院進行常規超聲檢查并經病理證實為乳腺癌的患者共計98例，患者均為女性，年齡27～76歲（47.6±9.3歲）。納入標準：術前在我院行超聲檢查且圖像滿意者；在超聲檢查前未接受過任何形式的治療；在我院行手術切除病灶獲得病理組織前未行任何形式的治療；具有完整臨床和隨訪資料的患者。排除標準：超聲檢查前、手術切除病灶獲得病理組織前存在肝腎等主要臟器功能障礙者；同時確診為其他部位惡性腫瘤的患者；失訪病例。本研究已通過本院倫理委員會審批，并且均已取得患者及其家屬的知情同意。

1.2 儀器與方法

1.2.1 超聲儀器及診斷標準 采用Logic-E9彩色多普勒超聲系統（GE），9L-4探頭，機械指數0.16。檢查時患者平臥位，雙上肢外展，充分暴露雙側乳腺及腋窩，必要時囑患者側身。檢查范圍為雙側乳房及腋窩，參照BIRADS標準［10］觀察病灶特征。乳腺病灶超聲聲像圖觀察指標：（1）病灶邊緣毛刺征：無包膜，邊緣毛糙、不光整，可見蟹足樣的結構向外突出；（2）周圍高回聲暈：病灶周圍高回聲環；（3）縱橫比是否>1：在最大切面上，病灶前后徑與橫徑的比值≥1；（4）后方回聲衰減：病灶后方回聲低于周圍組織回聲，后緣甚至顯示不清；（5）鈣化灶：病灶內細點狀或點狀強回聲；（6）彩色多普勒血流信號Adler 分級法：0級：腫塊內未發現血流信號；1級：少量血流，可見1～2個點狀或短棒狀血流；2級：中量血流，可見3～4個點狀血管或1個較長的血管，其長度可接近或超過腫塊半徑；3 級：多量血流，可見5個以上點狀血管或2個較長的血管。分流分組以血流分級中0～2級為不豐富血流，3級為豐富血流。典型超聲圖像（圖1）。

圖1 乳腺癌常規超聲聲像圖Fig.1 Ultrasound image of breast cancer

1.3.2 組織樣本免疫組化分析及判定標準 術后沿劃線切面剖開病灶進行切片，采用Envision兩步法完成免疫組化染色，檢測腫瘤干細胞標志物CD44、CD24；EMT標志物E-cadherin、β-連環蛋白(β-catenin)、Vimentin、Ncadherin。免疫組化結果判定標準：CD44、E-cadherin在癌細胞細胞膜和細胞質中呈陽性表達，CD24在癌細胞細胞質中呈陽性表達，N-cadherin、β-catenin在癌細胞細胞膜中呈陽性表達，Vimentin在癌巢周圍組織細胞質中呈陽性表達。評分標準：每張切片隨機觀察5個高倍視野，并計數100個腫瘤細胞。采用細胞顯色強度評分與陽性腫瘤細胞百分比的乘積求得半定量評分，作為蛋白表達的相對強度。具體評分方法為：(1)按顯色程度分為四級：陰性(不著色)，弱陽性(淡黃色)，陽性(棕黃色)，強陽性(棕褐色)，分別為0、1、2、3分；(2)陽性腫瘤細胞百分比：<5%(0分)，5%～25%(1分)，25%～50%(2分)，50%～75%(3分)，>75%(4分)（圖2）。

圖2 乳腺癌腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物鏡下圖像Fig.2 Here are objective images of breast cancer tumor stem cells and epithelial mesenchymal transformation markers (Original magnification:×100).

1.3.3 其它因素的處理 依據患者ER、PR的表達情況將研究對象分為Luminal 型（ER 和或PR 陽性）和非Luminal型（ER和PR陰性）；依據病理組織學分級將研究對象分為≤II級組和≥III級組；依據臨床分期將研究對象分為≤II級組和≥III級組；依據乳腺腺體類型分為致密型組和脂肪型組；依據患者腋窩是否發生轉移分為轉移組和非轉移組，分析腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平在各分組中差異是否有統計學意義，有統計學意義的組納入腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平的多因素分析中。

1.4 統計學分析

應用SPSS24.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以n(%)表示，組間比較行χ2檢驗。對CD24、CD44、Ecadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin多因素相關性分析分別進行多因素logistic逐步回歸分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌超聲征象與腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平關系

腫瘤周邊有毛刺組CD44的表達水平高于無毛刺組（P=0.021）；腫瘤周邊有毛刺組N-cadherin的表達水平高于無毛刺組（P=0.030）；腫瘤周邊有毛刺組βcatenin的表達水平高于無毛刺組（P=0.012）；腫瘤周邊有毛刺組E-cadherin 的表達水平低于無毛刺組（P=0.008）；腫瘤邊緣有毛刺組與無毛刺組CD24、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。腫塊邊緣有高回聲暈組CD44 表達水平高于無回聲暈組（P=0.023）；腫塊邊緣有高回聲暈組E-cadherin表達水平低于無回聲暈組（P=0.024）；腫塊邊緣有高回聲暈組與無回聲暈組CD24、N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。

腫塊縱橫比>1組E-cadherin的表達水平低于縱橫比<1組（P=0.023）；縱橫比>1組與縱橫比<1組的CD24、CD44、N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。腫塊內有微鈣化組與無微鈣化組CD24、CD44、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。血流信號豐富組CD44的表達水平高于血流信號不豐富組差異有統計學意義（P=0.044），血流信號豐富組與血流信號不豐富組CD24、E-cadherin、N-cadherin、βcatenin、Vimentin 的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。后方回聲衰減組E-cadherin的表達水平低于后方無回聲衰減組，差異有統計學意義（P=0.007），后方回聲衰減組和后方回聲無衰減組CD24、CD44、Ncadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（圖3，P>0.05）。

圖3 乳腺癌超聲征象與腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平關系Fig.3 Relationship between ultrasonographic signs of breast cancer and expression level of tumor stem cells and epithelial mesenchymal transformation markers.

2.2 其他影響腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達的因素

致密型腺體組CD24的表達水平低于脂肪型腺體組（P=0.035）；致密型腺體組與脂肪型腺體組CD44、Ecadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。組織學分級≤II級組CD24的表達水平高于組織學分級≥III級組（P=0.018），組織學分級≤II級組β-catenin的表達水平高于組織學分級≥III級組（P=0.03）；組織學分級≤II級組與組織學分級≥III級組CD44、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。臨床分期≤II級組N-cadherin 的表達水平低于臨床分期≥III 級組（P=0.023），組織學分級≤II級組Vimentin的表達水平高于組織學分級≥III級組（P=0.004）；臨床分期≤II級組與臨床分期≥III級組CD24、CD44、E-cadherin、β-catenin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。

Luminal 型CD44 的表達水平低于非Luminal 型（P=0.003）；Luminal 型E-cadherin 的表達水平高于非Luminal 型（P=0.034）；Luminal型與非Luminal 型CD24、N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。腋窩淋巴結有轉移組Ecadherin 的表達水平低于腋窩淋巴結無轉移組（P=0.037）；腋窩淋巴結有轉移組Vimentin的表達水平高于腋窩淋巴結無轉移組（P=0.011）；腋窩淋巴結有轉移組與腋窩淋巴結無轉移組CD24、CD44、N-cadherin、βcatenin的表達水平差異無統計學意義（圖4，P>0.05）。

圖4 其它可能影響腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達的因素與其表達水平關系Fig.4 Other factors that may affect the expression of tumor stem cells and epithelial mesenchymal transformation markers and their expression levels.

2.3 乳腺癌超聲征象及其他因素與腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平的相關性分析

以腺體類型、組織學分級為自變量，CD24的表達水平為因變量進行有序多分類logistic回歸分析，結果顯示：腺體背景類型是CD24表達的獨立相關因素（P<0.05，表1）。以腫塊有無毛刺、有無高回聲暈、腫塊血流情況及依據雌、孕激素受體分型為自變量，CD44的表達水平為因變量進行有序多分類logistic回歸分析，結果顯示：血流情況、依據雌孕激素受體的非luminal 型、luminal型分組是CD44表達的獨立相關因素（P<0.05，表2）。以有無毛刺、有無高回聲暈、腫塊縱橫比、后方回聲特征、依據雌、孕激素受體分型、淋巴結是否轉移為自變量，E-cadherin表達水平為因變量進行有序多分類logistic回歸分析，結果顯示：有無高回聲暈、腫塊后方回聲特征、腋窩淋巴結是否有轉移是E-cadherin表達的獨立相關因素（P<0.05，表3）。以邊緣有無毛刺、臨床分期為自變量，N-cadherin的表達水平為因變量進行有序多分類logistic 回歸分析，結果顯示：臨床分期是Ncadherin表達的獨立相關因素（P<0.05，表4）。以腫塊邊緣有無毛刺、組織學分級為自變量，β-catenin的表達水平為因變量進行有序多分類logistic回歸分析，結果顯示：邊緣有無毛刺是β-catenin表達水平的獨立相關因素（P<0.05，表5）。以臨床分期、腋窩淋巴結是否轉移為自變量，Vimentin的表達水平為因變量進行有序多分類logistic回歸分析，結果顯示：臨床分期是Vimentin表達的獨立相關因素（P<0.05，表6）。

表1 CD24表達水平多因素分析Tab.1 Multivariate analysis of CD24 expression level

表2 CD44表達水平多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of CD44 expression level

表3 E-cadherin表達水平多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of E-cadherin expression level

表4 N-cadherin表達水平多因素分析Tab.4 Multivariate analysis of N-cadherin expression level

表5 β-catenin表達水平多因素分析Tab.5 Multivariate analysis of β-catenin expression level

表6 Vimentin表達水平多因素分析Tab.6 Multivariate analysis of vimentin expression level

3 討論

EMT作為近些年來被人們逐漸證實與乳腺癌侵襲性顯著相關的研究［5-7］，與其相關的分子生物學機制的研究也日趨成熟。EMT 賦予乳腺癌干細胞的特征：乳腺癌干細胞與乳腺干細胞都具有自我更新能力和分化多潛能性，通常具有CD44+/CD24-的表型，其具有促進腫瘤復發和轉移的能力［11-12］。EMT 的相關標志物：Ecadherin下調與EMT顯著相關，E-cadherin的下調會使腫瘤的侵襲和轉移性明顯增加［13-16］。在惡性腫瘤的進展過程中，鈣黏蛋白從E型轉變為N型說明腫瘤細胞發生了EMT，這種轉變會增加細胞侵襲和轉移的能力［17］。Vimentin是間充質細胞表達的中間絲蛋白，在乳腺癌中Vimentin的表達增加經常被作為細胞發生EMT標志［18］。β-catenin是一個胞質斑蛋白，位于正常上皮細胞及非侵襲性腫瘤細胞膜上，但是發生上皮間質轉化時它不僅位于細胞質中也位于細胞核中，這表明β-catenin與乳腺癌的侵襲遷移密切有關［19-20］。本研究檢測腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物在乳腺癌組織中的表達，并分析其與乳腺超聲征象之間的關聯性。

毛刺征作為主要的乳腺癌邊緣超聲征象之一，其在預測腫瘤的侵襲性方面有著十分重要的價值。有研究顯示，乳腺癌邊緣表現為毛刺特征者的惡性可能性為84%，且容易出現淋巴和血行轉移［21］。近年來研究發現，乳腺癌腫塊邊緣“毛刺征”能分泌大量血管活性物質，如血管內皮生長因子等，進而誘導腫瘤新生血管形成，促進癌細胞轉移，因此有邊緣毛刺特征患者較無此征象者預后差［22］。以上研究均表明毛刺征是預測乳腺癌轉移的的重要超聲征象之一。本研究結果顯示：腫瘤周邊有毛刺組CD44、N-cadherin、β-catenin的表達水平高于無毛刺組，腫瘤周邊有毛刺組E-cadherin的表達水平低于無毛刺組，并且有無毛刺是β-catenin的獨立相關因素，這表明腫瘤周邊有毛刺組更容易發生EMT，可能潛在的侵襲風險也越高，這與以上研究結果相一致。乳腺癌高回聲暈作為另一個重要乳腺癌超聲征象，其也是預測乳腺癌侵襲性重要影像學表現。有研究結果為有高回聲暈的乳腺癌發生淋巴結轉移率高達71.3%(82/115)，明顯高于無高回聲暈者的50.0%(27/54)［23］。本研究結果顯示：腫塊邊緣有高回聲暈組CD44表達水平高于無回聲暈組，腫塊邊緣有高回聲暈組E-cadherin表達水平低于無回聲暈組，CD44的高表達和E-cadherin低表達預示著高回聲暈組的乳腺癌更容易發生EMT，也預示著腫塊周邊有高回聲暈的乳腺癌其侵襲性更強，這與現有研究結果一致。腫塊縱橫比>1組E-cadherin的表達水平低于縱橫比<1組，后方回聲衰減組E-cadherin的表達水平低于后方無回聲衰減組，這表明縱橫比>1組和后方回聲衰減組均更容易發生EMT，其可能存在更大的轉移風險，縱橫比、腫塊后方回聲衰減與乳腺癌侵襲轉移方面的報道還非常有限，還需要進一步的研究證實。有學者通過對174分活檢標本的研究發現微鈣化通過巨噬細胞介導上皮向間質轉化驅動乳腺癌的發生和發展［24］，另有研究報道腫塊內微鈣化是乳腺癌發生轉移的獨立危險因素［23-25］，但本研究結果顯示腫塊內有無微小鈣化與CD24、CD44、E-cadherin、N-cadherin、βcatenin、Vimentin的表達差異均無統計學意義，后續還會通過增加樣本量或者改進實驗方法進一步研究。血流信號豐富組CD44的表達水平高于血流信號不豐富組提示腫塊內的血流越豐富，腫瘤越有可能發生EMT，發生轉移的可能性越大，這與以往研究表明基于Adler半定量法的血流分級與淋巴結轉移存在正相關的結論相符［26-27］。

此外，我們對乳腺癌超聲征象之外可能影響腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物的表達的因素也做了相應的研究。本研究中致密型腺體患者57例，脂肪型腺體41例，致密型腺體的CD24的表達水平低于脂肪型腺體組。有研究表明，與非致密的乳腺組織相比，致密的乳腺組織其干細胞的數量和活性較非致密的乳腺組織明顯增加［27］，但致密型腺體的乳腺癌患者是否更容易發生EMT還需要后期的進一步研究。統計結果顯示組織學分級越高、臨床分期越高，發生EMT的風險越大，而組織學分級越高，惡行程度越高，侵襲性越強，惡性行為越明顯［28］。臨床分期也是依據腫塊大小、淋巴結轉移和遠處轉移來定義的。在非luminal型（ER和PR陰性）乳腺癌患者中CD44的表達明顯高于luminal型（ER和或PR陽性），而E-cadherin 明顯低于luminal 型，說明非luminal型較luminal型乳腺癌更容易發生EMT，預后可能也越差，這一結果也證實了ER、PR表達為陰性的乳腺癌侵襲性及惡性程度極高，具有無限增殖和復制、生長抑制作用抵抗、免疫逃避、活化炎癥反應、侵襲和轉移、誘導血管生成、基因組不穩定性、細胞凋亡抵抗和能量代謝異常等特征［29-30］。發生腋窩淋巴結轉移的患者E-cadherin明顯低于未發生轉移者，Vimentin明顯高于未發生轉移組，而E-cadherin低表達、Vimentin高表達說明更容易發生EMT，進一步驗證了EMT的發生促進腫瘤發生轉移。

綜上所述，乳腺癌超聲征象與腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物的表達水平存在內在聯系，超聲征象在一定程度上體現腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物的表達情況，可作為術前預測乳腺癌患者腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物的表達的無創性手段，進而為乳腺癌患者診斷、術前治療及預后評估提供指導依據。但是，目前研究的病例數較少，患者的預后及長期生存率等還需要后期較長時間的隨訪；其次，本研究分組相對簡單，標志物的指標也是采用等級資料方法。后期將利用RTPCR定量檢測手段檢測腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平情況，并探討新輔助化療后乳腺癌常規超聲征象的改變、超聲造影下的表現以及腫瘤干細胞及上皮間質轉化標志物表達水平情況。