食管癌組織中PTPN12的表達及其對Yes-2細胞惡性生物學行為的影響

牛云峰，楊 陽，王欣晨，沈素朋，郭 煒，董稚明

食管癌位居全球惡性腫瘤病死率的第6位。食管癌主要分兩類：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)[1]。我國是ESCC的高發國，且地域分布上有明顯差異，河北省太行山地區是食管癌的高發區。ESCC的早期癥狀不明顯，起病較隱匿，多數患者出現癥狀時已是中晚期，且術后5年生存率較低，因此尋找早期診斷和預后評估的分子指標及發病機制是提高患者生存率的重要手段。非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(protein tyrosine phosphatase non-receptor type12, PTPN12)基因定位于染色體7q11.23，其N末端含有PTPs家族的保守磷酸酶結構，C端則為PEST序列(脯氨酸P、谷氨酸/門冬氨酸E、絲氨酸S及蘇氨酸T殘基)，所以也稱PTP-PEST[2]。PTPN12是一種重要的腫瘤抑制因子，在細胞中普遍表達，通過多個靶標的去磷酸化調節細胞內信號傳導，是細胞遷移和黏附的重要調節劑，但有關PTPN12在ESCC中的表達及生物學特性的研究較少。因此，本實驗首先檢測PTPN12在ESCC組織中的表達情況，分析其與臨床病理特征的關系；其次檢測PTPN12在ESCC細胞系中表達情況，為進一步探討PTPN12在ESCC中的生物學作用。本實驗通過構建pcDNA3.1-PTPN12過表達質粒，轉染ESCC細胞，檢測其對ESCC細胞體外增殖、遷移、侵襲能力的影響，從而為PTPN12抑制ESCC的發生、發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國PAN-Biotech公司；TRIzol購自北京索萊寶公司；反轉錄試劑盒、綠色體系均購自美國Promega公司；所用引物均由北京賽百盛基因公司合成；兔抗人PTPN12多克隆抗體(E-AB13541)購自中國Elabscience公司；SP法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 標本來源收集2017年6月1日～2019年6月1日河北醫科大學第四醫院生物標本庫ESCC合計60例，其中男性47例(78.3%)，女性13例(21.7%)；中位年齡62歲(37～78歲)。所有患者術前均未行放、化療。每對標本均取ESCC原發灶及距原發灶5 cm以上的癌旁正常組織。手術切除標本分為兩部分，一部分在新鮮狀態下放入RNA later中，置于4 ℃冰箱中孵育過夜，再轉到-80 ℃低溫冰箱中保存，以備提取RNA；另一部分標本經10%中性福爾馬林固定，常規制作蠟塊后，4 μm厚切片，并進行HE染色及病理分析：癌組織標本由3位病理醫師確診為ESCC，癌旁正常組織中未見癌細胞浸潤。所有標本均具有完整的臨床病理資料，本組所有研究對象均簽署知情同意書，并經河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準通過。

1.3 ESCC細胞系及其培養ESCC細胞(TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2)由河北醫科大學第四醫院河北省腫瘤研究所病理研究室保存并傳代。6株細胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。

1.4 方法

1.4.1RT-qPCR 依據TRIzol試劑說明書步驟，提取ESCC細胞系、ESCC及其相應癌旁正常組織標本中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書步驟將總RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以β-actin為內參，進行RT-qPCR擴增。RT-qPCR引物如下，PTPN12上游引物5′-GTCCTGACCACAAT GGGGAG-3′，下游引物5′-CGGCTGTGATCAAATGG CAG-3′；β-actin上游引物5′-ACCGAGCGCGGCTA CAG-3′，下游引物5′-CTTAATGTCACESCCCGAT TTCC-3′。RT-qPCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，合計35個循環；72 ℃延伸7 min，每個樣本設3個復孔。根據每孔熒光信號達到閾值時經歷的循環數記為該組織中PTPN12和β-actin基因轉錄水平的Ct值。采用相對定量法：△Ct=CtPTPN12-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct癌組織-△Ct配對癌旁組織，以N=2-△△Ct表示目的基因的相對表達量，其數值表示癌組織相對于癌旁正常組織的相對倍數。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2免疫組化 應用免疫組化SP法檢測ESCC組織中PTPN12蛋白的表達。石蠟切片經常規脫蠟，梯度乙醇脫水，采用EDTA(pH 9.0)緩沖液進行抗原熱修復，高壓修復3 min，3%甲醇過氧化氫對內源性過氧化物酶進行封閉，后加入一抗(1 ∶200)4 ℃過夜，第2天依次加入生物素化二抗和辣根過氧化物酶標記的三抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水，透明，中性樹膠封固。采用半定量雙評分標準進行評分，每張切片隨機選取5個不重疊的高倍視野(400×)，以排除邊緣效應。PTPN12在食管鱗狀上皮的實質細胞和間質細胞的胞質中均有表達，但主要表達于實質細胞胞質。根據染色深淺和著色細胞所占的百分比進行評分[3]。染色強度：對切片組織的著色強度進行分類，棕褐色、棕色、淡黃色、未著色分別記為3、2、1、0分；染色范圍>75%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、<5%依次記為4、3、2、1、0分。染色結果為染色強度和染色范圍的乘積：強陽性(9～12分)，陽性(5～8分)，弱陽性(1～4分)，陰性(0分)；最終定義0～4分為低表達，5～12分高表達。所有切片均由3位有經驗的臨床病理醫師采用雙盲法評估閱片，然后根據其評分的平均值來確定判定結果。

1.4.3過表達載體pcDNA3.1-PTPN12轉染Yes-2細胞 選擇生長狀態良好的Yes-2細胞用胰酶消化并計數，將Yes-2細胞均勻鋪于6孔板，細胞長至80%左右時轉染，分別在2個EP管中加入無血清培養基與過表達載體質粒pcDNA3.1-PTPN12、無血清培養基與轉染試劑Lipofectamine 2000[轉染試劑Lipofectamine 2000(體積) ∶質粒(質量)=2 ∶1]，室溫孵育5 min；將2個EP管中的液體混合，室溫孵育20 min；其中1孔加200 μL轉染試劑質粒混合液作為實驗組(pcDNA3.1-PTPN12)，1孔加等量空質粒作為空質粒對照組(pcDNA3.1-NC)，1孔為常規細胞培養組(Yes-2空白組)。培養24～48 h后，收集Yes-2細胞提取總RNA，用于觀察細胞轉染PTPN12后mRNA的表達情況[4]。

1.4.4MTS實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞增殖的影響 將上述Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-PTPN12組的Yes-2細胞培養24 h后，常規消化并懸浮于培養基中，調整細胞濃度分別接種于96孔板(1 000個/孔)，每組設置3個復孔。分別于細胞貼壁后0、24、48、72和96 h在每孔加入MTS試劑20 μL(1 500 μg/mL)，孵育2 h后用酶標儀測定492 mm處的光密度(OD)值，代表細胞增殖水平。

1.4.5克隆形成實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞增殖的影響 將上述3組細胞分別接種于6孔板(3 000個/孔)，常規培養1周。4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下計數克隆形成數，大于50個細胞為1個克隆，分別計算3組細胞的克隆形成率。

1.4.6遷移實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞遷移能力的影響 將上述3組細胞接種于小室(1×105個/孔)，小室上層不加Matrigel膠，下層加600 μL含10%胎牛血清的完全培養基。常規培養24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下計數5個隨機視野內的細胞數，比較pcDNA3.1-PTPN12組和對照組的差異。

1.4.7Transwell侵襲實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞侵襲能力的影響 小室上層加20 μL Matrigel膠，其余同遷移實驗相同。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。首先對計量資料進行正態性檢驗，非正態分布的計量資料以中位數及四分位數表示，采用2個隨機樣本的非參數檢驗(秩和檢驗)進行組間分析；正態分布數據的多組間均數比較采用單因素方差分析，組內兩兩多重比較采用SNK-q檢驗；計數資料的組間比較采用四格表χ2檢驗；以上結果均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCC組織及其癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達首先對原始數據進行正態性檢驗，結果P<0.1為非正態，則使用非參數檢驗(秩和檢驗)進行統計，統計量以中位數及四分位數(M25q 75q)表示。ESCC組織中PTPN12 mRNA的相對表達量(0.833)顯著低于癌旁正常組織(Z=-3.179，P=0.001，圖1)。ESCC組織中PTPN12 mRNA表達與有無淋巴結轉移(Z=-2.074，P=0.038)相關；與腫瘤TNM分期、年齡、性別以及分化程度均無關(P>0.05，表1)。

圖1 食管鱗狀細胞癌組織及其相應癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達：*P<0.01

2.2 ESCC組織中PTPN12蛋白的表達PTPN12蛋白在ESCC組織及癌旁正常組織中的陽性率分別為31.7%(19/60)和70.0%(42/60)(圖2)，差異有統計學意義(χ2=17.638，P<0.01)。ESCC組織中PTPN12蛋白表達與腫瘤TNM分期(χ2=4.627，P=0.031)和有無淋巴結轉移(χ2=5.287，P=0.021)相關；與患者年齡、性別及分化程度均無關(P>0.05，表1)。

表1 ESCC組織中PTPN12表達與臨床病理特征的關系

圖2 A.PTPN12蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中低表達，SP法；B.PTPN12蛋白在癌旁正常組織中高表達，SP法

2.3 ESCC細胞系中PTPN12 mRNA的表達對照組、TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2的PTPN12 mRNA相對表達量分別為0.977±0.023、0.769±0.111、0.625±0.030、0.443±0.008、0.443±0.016、0.091±0.002和0.047±0.002，均低于對照組(F=170.492，P<0.01，圖3)；綜上所述，PTPN12在6株ESCC細胞系中的表達均低于對照組。其中Yes-2細胞表達最低，故選用Yes-2細胞進行后續實驗。

圖3 食管癌細胞系中PTPN12 mRNA的表達：*P<0.01

2.4 PTPN12過表達載體轉染Yes-2細胞的轉染效率Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組PTPN12 mRNA的相對表達量分別為0.957±0.043、0.992±0.070和2.838±0.197，pcDNA3.1-PTPN12組的表達量顯著升高(F=228.830，P<0.01，圖4)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無統計學意義(t=0.450，P=0.539)。

圖4 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因的驗證：*P<0.01

2.5 PTPN12過表達對Yes-2細胞增殖能力的影響MTS實驗結果顯示，在Yes-2細胞中過表達PTPN12(pcDNA3.1-PTPN12組)，與對照組相比，72 h其增殖能力顯著減弱(F72 h=17.924，P<0.01，表2，圖5)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細胞增殖能力差異無統計學意義(t=0.785，P=0.410)；96 h其增殖能力顯著減弱(F96 h=18.082，P<0.01)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細胞增殖能力差異無統計學意義(t=3.624，P=0.106)。克隆形成實驗結果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的克隆形成數分別為604.667±11.015、610.667±13.650和469.333±17.616，差異有統計學意義(F=93.025，P<0.01，圖6)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無統計學意義(t=-0.093，P=0.776)。

表2 PTPN12過表達后不同時間點Yes-2細胞增殖能力

圖5 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因MTS實驗：*P<0.01

圖6 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因克隆形成實驗

2.6 PTPN12過表達對Yes-2細胞遷移能力的影響遷移實驗結果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的遷移細胞數分別為831.333±16.289、815.667±27.683和436.000±37.162差異有統計學意義(F=186.939，P<0.01，圖7)，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組差異無統計學意義(t=-0.672，P=0.458)。

圖7 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因遷移實驗

2.7 PTPN12過表達對Yes-2細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組通過人工基膜的細胞數量分別為345.667±23.159、331.333±15.373和205.333±13.796(F=55.724，P<0.01，圖8)，pcDNA3.1-NC組和Yes-2空白組差異無統計學意義(t=0.680，P=0.456)。

圖8 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因侵襲實驗

3 討論

PTPN12于1992年首次被發現，為88 kDa胞質PTP，定位于染色體7q11.23。PTPN12含有50～60個氨基酸的N-末端區域，可連接240個氨基酸的PTP催化結構域(催化殘基Cys231和Arg237)，從而介導磷酸酶活性。PTPN12還有1個約500個氨基酸的C末端尾部，包括PEST序列和4個富含脯氨酸的結構域(P1、P2、P3、P4)以及含有信號轉導基序的NPLH序列。已有研究表明PTPN12在多種腫瘤中低表達，包括乳腺癌、血管肉瘤、肝細胞癌、結直腸癌以及黑色素瘤等[5-10]。PTPN12可抑制多種致癌酪氨酸激酶的活性[11]，以及調節腫瘤細胞的侵襲、遷移和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程。Piao等[12]研究發現膀胱移行細胞癌組織中PTPN12表達顯著降低，PTPN12表達與腫瘤大小、TNM分級、分化程度和腫瘤復發呈負相關；敲低PTPN12可以促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[13]研究顯示肝細胞癌中PTPN12表達顯著降低，PTPN12表達與EMT、遷移、侵襲和不良預后相關。Wang等[14]研究發現在預測卡培他濱對乳腺癌治療新輔助化療療效中發現PTPN12表達與細胞周期相關。有研究發現PTPN12在結直腸癌中與EGFR通路失調、增殖、遷移以及不良預后有關[15-16]。Thummuri等[17]研究指出在三陰型乳腺癌中DNA啟動子甲基化可能是導致PTPN12表達下調的表觀遺傳學機制之一。

PTPN12在食管癌中的表達已得到初步研究，但研究尚淺，因此本實驗首先檢測PTPN12在ESCC及癌旁正常組織中的表達情況，結果表明，與癌旁正常組織相比，ESCC組織中PTPN12 mRNA的表達量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結轉移相關，PTPN12蛋白的表達量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結轉移、TNM分期相關。這與上述研究報道一致，PTPN12 mRNA與TNM分期無相關性，而PTPN12蛋白與TNM分期相關，其可能原因為樣本量較少，后續實驗應進一步增加樣本量。上述結果提示PTPN12在ESCC中可能發揮抑癌基因作用。為進一步研究PTPN12對ESCC體外增殖、遷移、侵襲等生物學特性的影響，本組檢測了6種ESCC細胞系中PTPN12 mRNA的表達情況，PTPN12在6種ESCC細胞系中的表達均低于對照組，其中Yes-2細胞中的表達最低，故選用Yes-2細胞進行后續實驗。

本實驗基于PTPN12轉錄本1的序列構建出克隆載體，成功構建pcDNA3.1-PTPN12過表達載體，轉染Yes-2細胞，本實驗通過RT-qPCR法檢測Yes-2細胞中PTPN12 mRNA的表達情況，結果顯示轉染PTPN12過表達載體質粒后，細胞中PTPN12 mRNA表達明顯上調。通過MTS實驗、克隆形成實驗、劃痕實驗、遷移實驗和Transwell侵襲實驗，觀察PTPN12在體外對ESCC生物學行為的影響。應用MTS和克隆形成實驗發現轉染后的Yes-2細胞增殖能力降低，Transwell侵襲實驗發現轉染后的Yes-2細胞侵襲能力降低，應用遷移實驗發現轉染后的Yes-2細胞遷移能力降低，劃痕實驗發現轉染后的Yes-2細胞遷移能力有所降低，但差異無統計學意義。分析其原因可能是Yes-2細胞本身分化程度所致，具體原因還有待進一步的實驗證實。

有研究表明，PTPN12主要表達于細胞質，可作為調節細胞侵襲和轉移受體信號傳導的關鍵開關。PTPN12通過4個脯氨酸基序(P1-P4)使多種底物去磷酸化來發揮相應的生物學作用。Chen等[18]研究指出PTPN12通過黏著斑蛋白p130Cas去磷酸化來調節膠質母細胞瘤細胞的增殖和侵襲。Xu等[19]研究指出乳頭狀腎細胞癌中，活性氧(ROS)誘導PTPN12氧化失活，降低致癌激酶(ABL1)的去磷酸化并導致腫瘤細胞增殖和侵襲。有趣的是，Liang等[20]研究發現在卵巢癌中PTPN12與miR-194表達呈負相關，miR-194可直接結合PTPN12的3′UTR區，miR-194通過靶向PTPN12從而促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同樣Cheng等[21]研究發現miR-503通過直接靶向PTPN12，抑制PTPN12的表達，從而促進視網膜母細胞瘤的發生、發展。因此，以上研究可為PTPN12在ESCC中進一步研究下游機制提供思路。

綜上所述，本實驗結果表明，PTPN12在ESCC中低表達，并與ESCC的發生、發展密切相關，過表達PTPN12可以抑制Yes-2細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力，從而改變ESCC的生物學行為，為ESCC的分子靶向治療提供一些新思路，但具體機制有待進一步探究。