非小細胞肺癌中PDGF-BB表達及其與骨轉移的相關性

任鵬飛，王 弦，李晶晶，琚 倩，孟晨旭，龍其河，金像婷，李煩繁

肺癌是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，確診時約50%已為晚期，骨是其主要的轉移部位之一，約40%患者可發生骨轉移，肺癌骨轉移后患者的中位生存時間僅為6～10個月，經過治療后1年生存率也僅為40%～50%，且嚴重影響患者的生活質量[2]。目前，影像學和骨代謝標志物對于骨轉移的發現多數只能在骨轉移發生和進展時，存在一定的滯后性。因此，發現NSCLC骨轉移發生、發展過程中的關鍵因子，對于骨轉移發生發展的早期預測，以及患者的治療和預后具有重要意義。本組前期研究發現：2例PDGF-BB陽性NSCLC患者在后續隨訪中發生骨轉移的時間，較PDGF-BB陰性者早，提示PDGF-BB可能作為NSCLC骨轉移的預測指標[3]。本組在前期研究基礎上，進一步分析PDGF-BB在NSCLC患者血清及組織中的表達情況，探究其與遠處轉移(尤其是骨轉移)的關系，為預測NSCLC骨轉移的發生及預后提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月安徽醫科大學第二附屬醫院病理確診為NSCLC，經影像學檢查證實已發生遠處轉移、隨訪資料和組織標本完整的86例NSCLC作為轉移組，其中61例發生骨轉移納入骨轉移組，25例發生除骨轉移外的其他部位遠處轉移納入除外骨轉移的遠處轉移組。另選取56例同期診斷為NSCLC、未發生遠處轉移的標本作為無轉移組。兩組患者年齡、性別、腫瘤大小及病理類型之間差異無統計學意義。87例血液樣本取自2019年10月～2021年1月經病理確診、未經治療的NSCLC患者。根據患者的入院分期檢查將血液標本分為三組，(1)骨轉移組：發生骨轉移；(2)除外骨轉移的遠處轉移組：除骨轉移外的其他部位遠處轉移；(3)無轉移組：未發生遠處轉移。

1.2 主要試劑PDGF-BB酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購于武漢伊萊瑞特公司，兔抗人PDGF-BB(bs-1316R)多克隆抗體購自北京博奧森公司，羊抗鼠/兔二抗、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。其余主要試劑如乙醇、二甲苯等均為市購分析醇。

1.3 方法

1.3.1ELISA測定 所有患者在接受治療前于清晨空腹抽取，取靜脈血5 mL至普通離心管或采血管(采血管中不含抗凝劑、防腐劑或分離劑)，4 ℃放置30～45 min，3 000～5 000 r/min離心10 min，取上清檢測或保存在-80 ℃低溫冰箱。嚴格按照說明書的要求進行操作。分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，向相應的孔中加入稀釋好的標準品或血清樣品，每個標準品及樣品均設置復孔，每孔100 μL。37 ℃溫育90 min，棄去液體，甩干。每孔加生物素化抗體工作液100 μL，37 ℃溫育1 h，洗板3次。每孔加酶結合物工作液100 μL，37 ℃溫育30 min，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。每孔加50 μL終止溶液終止反應。用酶標儀在450 nm波長測量各孔的OD值，根據酶標儀所測標準品OD值及對應濃度，制作出標準曲線及回歸方程式，將樣本的OD值代入方程，計算出樣本濃度，乘以稀釋倍數，得出血清中PDGF-BB的實際濃度。

1.3.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法。將石蠟包埋組織4 μm厚切片、烘干、烤片，脫蠟水化，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓抗原修復，自然冷卻，加入內源性過氧化物酶阻斷劑，滴加一抗PDGF-BB(1 ∶400)，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min×3次，加入二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，分化，沖洗反藍，脫水，透明，封固。鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。

1.4 結果判斷PDGF-BB定位于細胞核及細胞質。(1)按著色腫瘤細胞所占比例評分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)根據染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性；結果由兩位資深病理醫師采用雙盲法進行判定。

1.5 統計學分析所有數據采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理。計量數據采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗或確切概率法。生存分析采用Log-rank檢驗并行Kaplan-Meier生存曲線進行單因素生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者血清中PDGF-BB的表達情況NSCLC骨轉移組、除外骨轉移的遠處轉移組、無轉移組患者的血清標本分別為23例、26例、38例。血清中PDGF-BB的濃度均數在骨轉移組、除外骨轉移的遠處轉移組、無轉移組間差異有統計學意義(P<0.001，表1)。骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組患者血清中PDGF-BB的濃度均高于無轉移組(P<0.05)，而骨轉移組PDGF-BB濃度高于除外骨轉移的遠處轉移組，但兩組間差異無統計學意義(P=0.077，圖1)。

表1 三組患者血清中PDGF-BB濃度

圖1 三組NSCLC患者血清中PDGF-BB濃度

2.2 NSCLC中PDGF-BB表達與臨床病理特征的關系PDGF-BB在NSCLC組織中同時表達于細胞質和細胞核(圖2)。142例NSCLC中PDGF-BB的陽性率為52.11%(74/142)，其中轉移組患者的PDGF-BB陽性率為65.12%(56/86)，高于無轉移組(32.14%，18/56)，差異有統計學意義(P<0.05)。TNM分期Ⅲ期患者的PDGF-BB陽性率為70.00%(21/30)，明顯高于Ⅰ期(33.33%，11/33)和Ⅱ期(53.16%，42/79)患者(P<0.05)；有區域淋巴轉移患者的PDGF-BB陽性率為65.15%(43/66)，高于無區域淋巴轉移患者(40.79%，31/76，P<0.05)。PDGF-BB表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型均無統計學意義(均P>0.05)，而與病理分期、區域淋巴結轉移、遠處轉移有關(P<0.05)。

圖2 NSCLC中PDGF-BB的表達：A．PDGF-BB在鱗狀細胞癌組織中呈陰性，SP法；B．PDGF-BB在鱗狀細胞癌組織中呈陽性，SP法；C．PDGF-BB在腺癌組織中呈陰性，SP法；D．PDGF-BB在腺癌組織中呈陽性，SP法

2.3 NSCLC骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組中PDGF-BB的表達86例轉移組患者中，骨轉移61例(70.93%)，除外骨轉移的遠處轉移25例(29.07%)。骨轉移組PDGF-BB陽性率為75.41%(46/61)，高于除外骨轉移的遠處轉移組(40.00%，10/25)，差異有統計學意義(P=0.002，表3)。

表2 非小細胞肺癌中PDGF-BB表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組PDGF-BB表達情況[n(%)]

2.4 骨轉移組PDGF-BB表達與無骨轉移生存時間(bone metastasis-free survival, BMFS)的關系BMFS是指腫瘤患者確診后未發生骨轉移的生存時間。本組骨轉移患者的中位BMFS為13個月(10.70～15.30個月)。骨轉移患者中，PDGF-BB陽性患者的中位BMFS為11個月(8.78～13.22個月)，PDGF-BB陰性患者的中位BMFS為22個月(16.32～27.68個月)，差異有統計學意義(P=0.003，圖3)。

圖3 非小細胞肺癌骨轉移組中PDGF-BB表達與患者無骨轉移生存的關系

3 討論

肺癌骨轉移嚴重影響患者的生存和生活質量，但目前肺癌骨轉移的機制尚未明確。惡性腫瘤骨轉移過程中有多種細胞(如成骨細胞、破骨細胞、骨基質細胞等)及細胞因子參與，如白介素-6、血管內皮生長因子、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factors, PDGFs)、甲狀旁腺激素相關肽等[4-6]。為探究NSCLC骨轉移過程中的關鍵因子，本課題組前期應用蛋白芯片篩選出PDGF-BB，發現其在骨轉移灶組織中有更高的陽性率。為進一步探究PDGF-BB與NSCLC骨轉移的關系，本實驗檢測了初診NSCLC患者血清以及NSCLC手術標本中PDGF-BB的表達，探究其在NSCLC骨轉移發生、發展及預后中的作用。

PDGF家族成員作為淋巴血管生成因子包括5個結構相關的成員PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD[7-8]。PDGF通過與血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor, PDGFR)-α和PDGFR-β結合，激活PDGFR通路來發揮生物學作用。PDGF-BB是唯一能同時激活PDGFR-α和PDGFR-β的配體，表明PDGF-BB有著更強的激活PDGFR通路的生物學效應[9-11]。有研究表明，PDGF-BB與腫瘤的生長、浸潤和遷移密切相關，PDGF-BB表達會使癌細胞將基質細胞和內皮細胞招募到腫瘤中，促進腫瘤的發生、發展[12-13]。腫瘤的進行性生長和轉移還取決于脈管系統發育(即血管生成)，而PDGF-BB表達可以促進腫瘤血管的生成[14]。本組發現，在NSCLC患者血清中，骨轉移組和除外骨轉移的遠處轉移組PDGF-BB濃度均高于無遠處轉移組(P<0.05)，提示PDGF-BB表達與NSCLC遠處轉移及骨轉移密切相關，提示PDGF-BB可能參與了NSCLC包括骨轉移在內的血行轉移過程。

有研究表明在骨轉移過程中，TGF-β從骨基質中釋放，通過Smad2/3/4信號促進腫瘤細胞分泌PDGF-BB[15]。同時，PDGFR-β通路還可通過自分泌和旁分泌機制激活[16-17]，誘導腫瘤細胞定植到骨。本實驗結果發現，已發生遠處轉移的NSCLC組織中PDGF-BB陽性率高于無轉移組；在轉移組中，骨轉移組PDGF-BB的陽性率高于除外骨轉移的遠處轉移組。且在骨轉移組中，PDGF-BB陽性患者的BMFS短于PDGF-BB陰性患者。上述結果提示：肺癌原發灶中PDFG-BB陽性患者發生遠處轉移尤其是骨轉移的可能性更高，且更早發生骨轉移。PDFG-BB表達對于NSCLC骨轉移的發生及發生時間具有一定的預測意義，但仍需進一步的探索PDGFR-β信號途徑在NSCLC骨轉移中的關鍵分子及相應作用機制。

此外，本實驗還發現PDGF-BB在NSCLC組織中的表達與患者年齡、組織學分級和腫瘤大小無關，而與臨床病理分期和區域淋巴轉移有關，與Zhang等[18]研究結果一致。這可能是因為腫瘤的淋巴轉移依賴于淋巴管生成[19]，淋巴管生成因子包括血管內皮生長因子和PDGF家族，PDGF-BB可以通過激活PDGFR-β信號通路來促進新的淋巴管形成，從而為腫瘤細胞的轉移提供了直接通道[20-21]。

本實驗為單中心回顧性研究，存在一定的局限性。本實驗主要探索PDGF-BB在NSCLC骨轉移中的作用機制，研究對象包括鱗狀細胞癌和腺癌，有文獻報道鱗狀細胞癌和腺癌具有不同的轉移潛能，而本組并未發現PDGF-BB在腺癌和鱗狀細胞癌間的表達差異，可能是由于納入的鱗狀細胞癌病例數較少，后續可再納入更多鱗狀細胞癌病例，分別分析鱗狀細胞癌和腺癌中PDGF-BB表達與骨轉移的關系，以便確定其在哪種類型NSCLC中更有價值。

綜上所述，PDGF-BB表達與NSCLC骨轉移密切相關，對于NSCLC骨轉移的發生及BMFS具有重要的預測價值，可能是NSCLC骨轉移過程中的關鍵因子。本組將進一步研究其分子機制，為PDGF-BB成為NSCLC骨轉移的重要預測指標及治療靶點提供理論基礎。