不同脫黑色素方法對HE和免疫組化染色結果的影響

林 娟，晉 龍，吳晶晶，郭國棟

惡性黑色素瘤的診斷依賴于HE及免疫組化染色結果。大部分黑色素瘤含有黑色素細胞，這影響了HE組織細胞形態觀察，且免疫組化中DAB染色呈棕黃色或棕褐色，易被黑色素顆粒物掩蓋，影響判讀。孫麗君和黃斌[1]提出的雙重氧化脫黑色素顆粒方法能較好的脫去黑色素顆粒；傳統的高錳酸鉀或過氧化氫也能夠脫去黑色素顆粒，有研究證實37 ℃溫箱加熱高錳酸鉀及65 ℃水浴加熱過氧化氫可加快祛掉黑色素[2-3]；微波加熱法也能加快脫去黑色素顆粒[4-5]。上述方法均能達到脫色素的效果，但未見文獻對脫黑色素后HE及免疫組化染色結果進行系統的比較。本實驗比較5種脫色素方法對HE及免疫組化染色結果的影響，用于輔助惡性黑色素瘤的鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集福建省立醫院病理科2015～2019年診斷的20例惡性黑色素瘤。其中男性11例，女性9例，患者年齡42～87歲，平均65.9歲。主要發病部位眼球5例、鼻腔8例、四肢7例。

1.2 主要試劑和儀器高錳酸鉀、草酸、30%過氧化氫購自同春藥業；Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas單克隆抗體購自福州邁新公司。Leica RM2245切片機，美的M1-211A微波爐。

1.3 試劑配制0.5%高錳酸鉀：0.5 g高錳酸鉀+100 mL蒸餾水；5%草酸：5 g草酸+100 mL蒸餾水；15%、10%、7.5%、5%過氧化氫：30%過氧化氫100 mL、50 mL、25 mL、15 mL+100 mL蒸餾水。

1.4 方法

1.4.1組織切片制備 20例石蠟組織標本3 μm厚連續切取切片46張。每組病例6張用于HE脫色前后對比染色，24張用于免疫組化(4種抗體)，16張用于4種濃度過氧化氫脫色素后免疫組化染色。

1.4.2脫色素方法 (1)高錳酸鉀脫色素法：0.5%高錳酸鉀10～20 min，2.5%草酸漂泊1～2 min。(2)高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL 0.5%高錳酸鉀的立式染缸，置微波爐中并調至最低檔輻射1 min，待冷卻2.5%草酸漂泊1～2 min。(3)過氧化氫(水浴加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL(15%、10%、7.5%、5%)過氧化氫的立式染缸內，置65 ℃水浴箱3～6 h。(4)過氧化氫(微波加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL 15%過氧化氫的立式染缸內，置微波爐最低檔加熱5～15 min。(5)雙重氧化脫色素法：15%過氧化氫30 min，蒸餾水洗后滴加0.5%高錳酸鉀5 min，水洗滴加2.5%草酸5 min。上述5種方法脫色素過程均在鏡下觀察黑色素基本消失后，待冷卻水洗。

1.4.3HE染色 組織切片脫蠟至水，流水沖洗后置蘇木精5 min，分化返藍，伊紅染色，脫水、透明、封片。

1.4.4免疫組化MaxVision兩步法 石蠟組織切片脫蠟、水化后進行酸修復；過氧化物酶阻斷劑封閉內源性過氧化酶活性；加一抗(Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas)室溫孵育；再加酶標二抗孵育；DAB顯色；蘇木精復染；脫水、透明、封片。

1.4.5脫黑色素前、后免疫表達符合情況判讀 陽性強度一致，且陽性百分率差異<10%定義為符合；陽性強度基本一致，陽性細胞百分率差異<20%定義為基本符合；陽性強度差別較大或陽性強度基本一致，但陽性百分率差異≥30%定義為不符合。

2 結果

2.1 HE染色結果高錳酸鉀脫色素法：細胞裂隙稍變大，細胞質伊紅上色效果不佳，胞核胞質顏色對比不夠明顯。高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：HE染色結果掉片率10%左右，細胞形態輕度改變，輕度腫脹、模糊，胞核胞質染色均很淡，對比模糊不清。過氧化氫脫色素(水浴加熱)法：組織完整性保持較好，但HE結果細胞核染色較淡，核質顏色區分欠佳。過氧化氫(微波加熱)法：出現細胞裂隙稍變大，細胞形態輕度改變。雙重氧化脫色素法：優于其他方法，染色結果組織完整，細胞形態完好，細胞核及細胞質顏色對比明顯，染色清晰(表1，圖1)。

圖1 黑色素瘤組織不同方法脫黑色素后HE染色：A.高錳酸鉀脫黑色素后HE染色；B.高錳酸鉀(微波加熱)脫黑色素后HE染色；C.過氧化氫(水浴加熱)脫黑色素后HE染色；D.過氧化氫(微波加熱)脫黑色素后HE染色；E.雙重氧化脫黑色素后HE染色 圖2 惡性黑色素瘤組織不同方法脫黑色素后Ki-67免疫染色，MaxVision兩步法：A.高錳酸鉀脫色素法；B.高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法；C.過氧化氫(水浴加熱)脫色素法；D.過氧化氫(微波加熱)脫色素法；E.雙重氧化脫色素法

表1 5種脫黑色素方法對HE染色的影響

2.2 免疫組化結果高錳酸鉀脫色素法：組織掉片率約20%，細胞形態改變，組織間隙增大，免疫定位不清。高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：脫黑色素后免疫組化染色不佳，組織掉片率約50%，細胞零散破碎，組織間隙變大，細胞、組織形態均改變較大，且極大影響抗原抗體反應的陽性強度及定位。15%過氧化氫(水浴加熱)脫色素法：脫黑色素后免疫組化染色結果優于其他方法，染色特異性較好，背景基本不著色或輕度著色，但出現陽性強度及陽性百分率稍變弱的情況。15%過氧化氫(微波加熱)脫色素法：細胞形態尚可，但陽性強度稍變弱，出現小范圍組織掉片，陽性覆蓋率降低，輕度背景著色。雙重氧化脫色素法：陽性強度變弱較過氧化氫法明顯，且免疫組化結果陽性覆蓋率下降(圖2)。

為進一步探究不同低濃度過氧化氫脫黑色素后對免疫組化染色結果的影響，本實驗將過氧化氫配制為5%、7.5%、10%、15%四組不同濃度，對20例黑色素瘤病例進行脫黑色素后行免疫組化Ki-67染色，結果顯示：5%過氧化氫對免疫組化染色結果影響最小，細胞形態得以保持，其陽性強度、定位及陽性覆蓋率相較脫黑色素前最為一致，5%、7.5%、10%、15%四組過氧化氫脫黑色素后Ki-67免疫染色符合率與基本符合率相加分別為95%、85%、80%、75%。本實驗將20例惡性黑色素瘤石蠟標本繼續用5%過氧化氫脫黑色素后行Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas染色，上述4項免疫指標的符合率分別為60%、75%、60%、30%，基本符合率分別為30%、20%、25%、55%，不符合率分別為10%、5%、15%、15%(表2)。

表2 5%過氧化氫脫黑色素后黑色素瘤組織中各抗體的表達符合情況

3 討論

黑色素是一種天然存在的低分子量材料，不溶于水和有機溶劑，在強堿中可以被溶解，也可以通過強氧化劑進行脫色。黑色素顆粒常掩蓋原有的細胞形態，且在免疫染色過程中極易與DAB色原混淆。如何有效脫去黑色素顆粒，并最小程度影響染色結果對于提高伴有黑色素病變的正確診斷率具有重要價值。

細胞質等電點pH在4.7～5.0，日常工作中HE染料pH 3.3～4.7，小于其等電點的pH，胞質表現為堿式電離，可被酸性染料染色，細胞核的等電點pH在3.3～3.6，表現酸式電離，可被堿性染料染色，胞質與胞核的染色被區分開。高錳酸鉀溶液的pH在7～7.5，組織經高錳酸鉀溶液后使胞質的pH向堿側移動，浸入伊紅染液后可能接近其等電點，出現胞質部分呈兼性離子，不對外顯電，因此伊紅較難使胞質染色，出現細胞質染色較淡。過氧化氫溶液pH為4.5，經過氧化氫脫黑色素后胞質染色過于突出，使得核質染色對比不明顯。可能經過氧化氫溶液后，胞質pH向酸側移動，接近3.3或以下，胞質表現堿式電離，染色體也表現堿式電離，因此胞質、胞核均易被帶負電荷的酸性染料染色，使得染色不易區分。經高錳酸鉀溶液后，再經過氧化氫溶液起到中和作用，胞質胞核的pH幾乎不發生變化，因此雙重氧化脫黑色素后HE染色效果最為理想。

5種脫黑色素方法檢測Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas分別定位于細胞核、細胞質及細胞膜的免疫指標，發現15%過氧化氫脫色素后免疫表達相對較好，無掉片，組織完整，細胞形態較為完好，免疫指標表達相對比較理想。其機制推測為高錳酸鉀在脫黑色素過程中一定程度上破壞了抗原的免疫原性和免疫反應性。免疫組化抗原有效熱修復溫度為85 ℃及以上，而在使用微波修復過程溫度再次達到85 ℃以上，抗原過度修復，致使組織掉片率增加，影響細胞形態，并出現背景著色。過氧化氫可與組織中內源性過氧化物酶反應，使內源性過氧化物酶不可逆的失活，從而阻斷組織中過氧化物酶的非特異染色，且其為辣根過氧化物酶的底物，催化DAB顯色。但當過氧化氫濃度過大時顯色反應過快會出現背景著色，且過量的過氧化氫可能抑制了酶的活性，出現抗原抗體的特異性及敏感性降低。因此為進一步了解不同更低濃度過氧化氫對免疫組化結果的影響，本組將過氧化氫濃度降至10%、7.5%及5%同樣檢測上述4種免疫指標，發現5%過氧化氫脫黑色素后行免疫組化結果相對理想，這一結果也符合上述觀點。

惡性黑色素瘤組織在行HE染色時，應用雙重氧化脫黑色素法染色結果最為理想，胞質胞核染色清晰，對比明顯。惡性黑色素瘤組織應用5%過氧化氫脫黑色素的方法行免疫染色細胞形態較好，背景干凈。免疫指標Ki-67、Melan-A和HMB45陽性強度、百分率及定位較脫黑色素前較一致，p130Cas表達相比于脫黑色素前符合率欠佳。