滁菊多酚氧化酶和過氧化物酶熱鈍化動力學研究

苗文娟，何鑫，夏玥，楊東東，孫昱，韋海陽

（1.滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000；2.安徽啟慧信息科技有限公司，安徽滁州239000）

滁菊又名“甘菊”、“白菊”，產于安徽省滁州市，素有“金心玉瓣、翠蒂天香”之美譽，是中國“四大名菊”之一[1]。滁菊富含黃酮、酚類、揮發油、氨基酸類及多糖等營養成分，具有抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、調節機體免疫力等多種藥理作用[2-6]。

新鮮采摘的滁菊新陳代謝活躍，極易腐敗變色，有研究表明引起植物褐變的主要原因是酶促褐變和非酶褐變，其中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）在酶促褐變過程中發揮主要作用[7]。褐變不僅改變了滁菊的顏色，而且還破壞了滁菊的風味和活性成分，嚴重限制了滁菊的加工利用。因此，有必要對滁菊中的PPO和POD酶學特性和鈍化動力學進行分析，為滁菊的精準殺青工藝開發提供理論基礎。

一級鈍化動力學是最常用的鈍酶、殺菌過程的描述方法[8]。在熱鈍酶理論研究中，多名研究者采用一級反應動力學研究酶鈍化情況[9-11]，KUBO等[12]研究了微波處理過程中溫度和POD酶活性的變化情況，測定了鈍酶反應的D值和Z值，表明一級鈍化動力學可以很好地預測POD酶在微波處理過程中的活性變化情況。吳倩等[13]對橄欖PPO和POD的熱失活動力學研究表明，高溫處理能有效地鈍化橄欖PPO和POD，且高溫處理對橄欖PPO和POD的鈍化過程符合兩段模型，提高處理溫度和延長處理時間能顯著提高橄欖PPO和POD的鈍化速率。楊明冠等[14]通過對蘋果PPO進行超聲鈍化動力學研究，發現隨著超聲處理功率的提高和時間延長，蘋果PPO的熱敏感性降低，k值上升，D值下降，蘋果PPO的鈍化符合一級反應動力學模型。而關于滁菊PPO和POD的熱鈍化動力學研究尚未明確，因此對滁菊中酶熱鈍化動力學進行的研究，可為滁菊采摘后殺青過程中控制酶促褐變反應及提升滁菊品質提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滁菊：2019年10月采自滁州市金玉滁菊生態科技有限公司種植基地；鄰苯二酚（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；愈創木酚（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L3S紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C pH計：上海越平科學儀器有限公司；BSA124S-CW電子分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滁菊PPO粗酶液提取

稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中，加入適量石英砂，加入30 mL預冷的0.1 mol/L、pH6.5磷酸鹽緩沖液，快速研磨后用絹布過濾，濾渣重新加入pH6.5磷酸鹽緩沖液，重復上述操作，合并兩次濾液于4℃、9 000 r/min條件下離心15 min，上清液轉入100 mL容量瓶并定容即得PPO粗酶液。

1.3.2 滁菊POD粗酶液提取

稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中，加入適量石英砂，加入30 mL預冷的0.1 mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液，快速研磨后用絹布過濾，濾渣重新加入pH6.0磷酸鹽緩沖液，重復上述操作，合并兩次濾液于4℃、9 000 r/min條件下離心15 min，上清液轉入100 mL容量瓶并定容即得POD粗酶液。

1.3.3 PPO酶活的測定

參照何軍忠等[15]方法并加以修改：取2.0 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH6.5）于比色皿中，加入 0.3 mL鄰苯二酚底物溶液（0.35 mol/L），加入0.2 mL PPO酶提取液后迅速混勻，立即放入分光光度計于420 nm處測定吸光值（動力學測量模式），從0 s開始每20 s讀數1次，計時1 min。每組平行測定3次并作空白對照。滁菊PPO酶活力定義為每分鐘每克滁菊鮮樣吸光值增加0.01為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 POD酶活測定

參照宋麗軍等[16]方法并加以修改：分別取配好的1 mL愈創木酚溶液（0.090 mol/L）和1 mL過氧化氫溶液（0.010 mol/L）于比色皿中，再加入0.15 mL粗酶液迅速混合均勻，以空白組作為對照，檢測A470nm處的吸光度變化（動力學測量模式）。從0 s開始每20 s讀數1次，計時1 min。以每分鐘每克滁菊鮮樣吸光度變化0.01為1個酶活力單位（U）。

1.3.5 滁菊PPO和POD最適溫度的測定

分別取適量磷酸鹽緩沖液和底物溶液置于試管中，在相應溫度下水浴保溫，按照1.3.3和1.3.4方法測定PPO和POD酶活力，考察溫度對滁菊PPO和POD活性的影響。

1.3.6 滁菊PPO和POD熱穩定性的測定

分別取5 mL滁菊PPO和POD粗酶液置于試管中，在50℃～100℃的水浴加熱磁力攪拌器中進行熱穩定性試驗，采用磁力攪拌以保證水浴加熱過程中樣品受熱的均勻性。各個溫度下加熱保溫時間見表1。加熱結束后立即取出樣品置于冰水浴中，冷卻至室溫（25℃±5℃）后測定酶活，對照樣為室溫放置的PPO和POD酶溶液。采用殘存酶活表示熱處理前后PPO和POD酶活的變化。

表1 滁菊PPO和POD熱穩定性測定條件設置Table 1 Condition setting for the thermostability measurement of Chuju PPO and POD

1.3.7 動力學分析

參考XU等[17]與LING等[18]采用一級動力學描述一個特定的食品體系中酶的熱失活。

式中：t為熱處理時間，min；A為t時刻的樣品酶活；A0為初始酶活；k為失活速率常數，min-1；D為指數遞減時間，min。

酶對溫度的敏感性可以用Ea（J/mol）來表示，Ea可從失活速率常數的自然對數ln（k）與溫度的倒數1/T（T為絕對溫度）作圖所得回歸曲線的斜率中求出[17]。

1.4 數據處理

所有試驗數據均重復3次，數據采用Excel 2007進行數據處理，用平均值±標準差的方式描述，采用Origin 2020軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 滁菊PPO和POD最適溫度

溫度對滁菊PPO和POD酶活性的影響結果見圖1。

圖1 溫度對滁菊PPO和POD酶活性的影響Fig.1 The effect of temperature on PPO and POD activities of Chuju

由圖1可見，滁菊PPO和POD的酶活性均隨著溫度的升高先上升再下降，但二者趨勢線有一定差別。滁菊PPO的最適反應溫度為30℃，同時在較低的溫度范圍內（40℃～60℃）酶活即開始下降。滁菊POD的最適反應溫度是45℃，POD在30℃～60℃相對酶活力均可保持在85%以上。亳菊[19]PPO的最適反應溫度是25℃，POD的最適反應溫度是30℃～35℃[20]，橄欖[21]中PPO最適反應溫度60℃，POD最適反應溫度40℃，由此可以看出不同來源的原材料中的PPO和POD酶學特性有較大差異。因此，在后期試驗過程中選擇在50℃以上溫度對滁菊PPO和POD進行進一步熱處理，并進行詳細的動力學研究。

2.2 滁菊PPO和POD熱穩定性分析

滁菊PPO和POD粗酶液分別在50℃～100℃處理一定時間后，殘存酶活試驗數據如表2所示。

表2 熱處理后PPO和POD相對酶活變化Table 2 The relative activity change of PPO and POD after heat processing

PPO和POD酶活隨著加熱時間的增加而降低，并且受到溫度的顯著影響。當PPO和POD在較低的溫度下處理時，酶活下降速率慢，隨著溫度升高，酶活下降速率增大。結果表明，加熱時間和溫度對PPO和POD失活有顯著影響。但需注意的是，在較低溫度下，如50℃，即使處理60 min后PPO仍殘存40.1%酶活，POD仍殘存86.4%酶活，處理75 min后二者酶活仍未顯著下降，表明在較低溫度下延長處理時間對酶的鈍化效果不顯著。

同時，由表2對比分析可見，滁菊PPO和POD對溫度的敏感性不同。在50℃處理30 min后PPO和POD的酶活分別降至初始值的51.8%和89.1%；60℃處理30 min后PPO和POD的酶活分別降至27.9%和60.1%；70℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至76.1%和81.8%；80℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至52.4%和59.1%，90℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至17.5%和20.0%，100℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至1.3%和4.7%，滁菊PPO對溫度的敏感性高于POD。

2.3 滁菊PPO和POD的熱失活動力學分析

2.3.1 熱處理對滁菊PPO和POD的k值和D值影響

基于滁菊PPO和POD熱穩定性數據，設計試驗研究了PPO和POD在50℃～100℃下的詳細熱失活動力學。以加熱時間為橫坐標，ln（A/A0）為縱坐標作圖，圖2和圖3分別是不同溫度下加熱后PPO和POD失活一級動力學變化情況。

圖2 滁菊PPO的一級鈍化動力學擬合結果Fig.2 Fitting result of firs order inactivation kinetics of PPO in Chuju

由圖2和圖3可見，PPO和POD熱失活線性擬合結果較好，說明PPO和POD的熱鈍化符合一級反應動力學，這與CAO等[22]對藍莓汁中PPO和POD的熱鈍化動力學研究結果一致。同時滁菊PPO和POD擬合后的直線斜率均隨著溫度的增加而增加，說明升高溫度會增強對PPO和POD酶活性的鈍化效果。滁菊PPO鈍化的擬合R2范圍在0.810 2～0.981 5，POD鈍化的擬合R2范圍在0.701 4～0.985 9。

圖3 滁菊POD的一級鈍化動力學擬合結果Fig.3 Fitting result of first order inactivation kinetics of POD in Chuju

酶的失活反應速率常數k可以從相對酶活的自然對數ln（A/A0）與時間t作圖所得的回歸線斜率中求得[23]。根據圖2、圖3的擬合數據和公式1、公式2可以計算得到滁菊PPO和POD酶的熱鈍化動力學參數k值和D值，D值指的是在一定條件下鈍化90%酶活所需的時間[24]，D值可以反映酶對溫度的敏感程度，D值越高，酶對溫度敏感性越低，相同溫度下鈍化效果越差，具體數據如表3所示。

表3 滁菊PPO和POD一級熱鈍化動力學參數Table 3 Kinetic parameters of thermal inactivation of PPO and POD in Chuju

由表3可見，PPO和POD的k值隨著溫度的增加而增加，D值隨著溫度的增加而減小，說明升高溫度會增強PPO和POD的鈍化效果。

從各個溫度下PPO和POD的D值變化，可以更容易發現兩種酶對溫度的敏感性差異，在相同溫度下比如在60℃時，PPO的D值為47.192 6 min，POD的D值為111.256 0 min，而溫度上升到70℃時，PPO的D值為 10.052 4 min，POD的 D值為 21.051 2 min，在100℃時，PPO的D值為 0.563 8 min，POD的D值為0.9553min，由此表明滁菊PPO較POD容易鈍化。

2.3.2 熱處理對滁菊PPO和POD酶的Ea值影響

滁菊PPO和POD的Ea擬合曲線見圖4。

圖4 滁菊PPO和POD的Ea擬合曲線Fig.4 Ea fitting curve of chuju PPO and POD

反應活化能Ea可通過Arrhenius方程求得，常用來評價反應溫度對酶失活速率常數k的影響。Ea越小，代表反應速率越快。圖4表明PPO和POD的ln k與溫度的倒數之間具有良好的相關性，R2均在0.96以上。由其斜率求得熱處理鈍化PPO和POD的Ea分別為 13.495 kJ/mol和17.092 kJ/mol，即需要 13.459 kJ的能量才能將1 mol的PPO分子鈍化，需要17.092 kJ的能量才能將1 mol的POD分子鈍化。從活化能的數據也可以說明滁菊PPO較POD對溫度更敏感，在熱處理過程中更易失活。

通常認為Ea＜40 kJ/mol時，則該反應的反應速率非常大[25]。因此，由上述數據可知高溫下滁菊中PPO和POD雖反應活化能有一定差異，但均屬于易于高溫失活的酶，因此，對滁菊進行高溫處理可有效鈍酶。

3 結論

熱處理對新鮮滁菊PPO和POD的鈍化有顯著效果，隨著熱處理溫度的提高、熱處理時間的增加，鈍酶效果越好，當溫度大于80℃對滁菊PPO和POD的熱鈍化效果較好，低溫長時對降低PPO和POD酶的活性效果不佳。

通過對滁菊PPO和POD的熱鈍化動力學分析，確定了這兩種酶的熱失活動力學參數。動力學分析數據表明，在50℃～100℃的等溫熱處理過程中，滁菊PPO和POD的熱失活符合一級動力學模型，隨著處理溫度的上升，滁菊PPO和POD鈍化的k值逐漸增加，D值逐漸降低，滁菊PPO一級鈍化模型線性擬合系數均在0.8以上，Ea=13.495 kJ/mol；滁菊POD一級鈍化模型線性擬合系數均在0.7以上，Ea=17.092 kJ/mol；與滁菊POD相比，滁菊PPO的熱穩定性較差，該結果為滁菊中PPO和POD酶的熱鈍化提供理論依據，也為滁菊殺青工藝研究提供了參考。