浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒品質的影響

郭錦濤，郝縉，徐懷德，李梅

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科枸杞屬的一種，果實稱枸杞子，是我國傳統的藥食兼用材料[1]，含有多種活性物質，如黃酮、類胡蘿卜素、多糖等[2]，具有增強人體各項機理的功效，如滋補虛弱、益精氣、去冷風、壯陽道、止淚、健腰腳等[3]。目前常見的枸杞深加工產品主要有枸杞果干、枸杞果汁和枸杞果酒等[4-5]。

枸杞浸提酒是將枸杞與白酒基酒按一定比例進行混合，在容器中浸泡一定時間，使枸杞內的生物活性成分浸入基酒中，制得的成品酒。枸杞浸提酒中含有如枸杞黃酮、枸杞多糖[6]、甜菜堿等多種活性成分。黃酮具有抗氧化[7]、改善血液循環[8]、降低血糖[9]等有益于人體的功能，是人體內不可或缺的一種功能性成分，適當地補充黃酮將會對人們的身體大有裨益。枸杞多糖構成成分有6種，分別為阿拉伯糖、葡萄糖、醋多糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖[10],在枸杞酒的功能中有著舉足輕重的地位[11]，具有醫治不孕不育[12]、抗氧化[13-14]、延緩衰老[15]、抗腫瘤[16]、抗輻射[17]、降血糖[18]等多種功效。甜菜堿具有抗腫瘤、降血壓、抗消化性潰瘍及胃腸功能障礙等功能，還可用于治療肝臟類疾病[19]。當甜菜堿作為飼料添加劑使用時，可以提供甲基供體[20]。

枸杞的浸提時間不同，其功效成分溶出程度不同，枸杞浸提酒的品質亦不同。因此枸杞在酒中的浸提時間是影響枸杞浸提酒品質的關鍵因素。本文比較了枸杞在不同酒度基酒浸提不同時間的品質變化規律（包括色澤、黃酮、多糖、甜菜堿及香氣成分），以期獲得不同酒度品質最佳的枸杞浸提酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮枸杞（含水量 80%）、基酒（酒度 67% vol）：青海興諾杞業有限公司；乙醇、蘆丁標準液、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒽酮試劑、濃硫酸、葡萄糖標準溶液、3，5-二硝基水楊酸、甲醇溶液、氨化甲醇、乙腈溶液（均為分析級試劑）：國藥集團試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設備

JM-A5002電子天平：諸暨市超澤衡器設備有限公司；DGH-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀：島津儀器有限公司；GCMSQP2010 Ultra氣相色譜質譜聯用儀：日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將鮮枸杞與基酒按一定比例混合，得到酒度為42% vol、45% vol、53% vol的枸杞浸提酒，密封瓶蓋。之后分別在枸杞浸泡 5、10、15、20、25 d 時進行取樣，用于枸杞酒品質指標測定，并對樣品按照酒度從低到高，浸提時間從短到長的順序進行編號，依次命名為1號至15號，待測。

1.3.2 色澤測定

將樣品按照酒度的不同分為3組，按照浸提時間從短到長的順序依次對樣品進行測定。色差儀先用標準黑白板校正，待自動校正完成之后，按下測試鍵，讀出標準樣的L*、a*、b*絕對值。用比色皿稱取適量樣品，放入色差儀內進行測定。記錄該樣品與標準樣的色差值：dL*、da*、db*等。其余樣品按照上述操作步驟重復操作[21]。

1.3.3 黃酮含量測定

蘆丁溶液標準曲線制作[22]：稱取10 mg蘆丁標準品，用30%乙醇定容至50 mL，搖勻后制得0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。分別取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL蘆丁標準溶液于10 mL容量瓶內，加入0.3 mL質量濃度為5%的亞硝酸鈉，搖勻之后靜置6 min，再加入0.3 mL質量濃度為10%的硝酸鋁，搖勻之后同樣靜置6 min，最后加入4 mL質量濃度4%的氫氧化鈉，以30%乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置10 min，以不加蘆丁的溶液為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度。橫坐標為吸光度值、縱坐標為蘆丁濃度（mg/mL），得標準曲線：y=0.095 9x-0.001 1，R2=0.988 2。

樣品含量測定：準確量取3 mL樣品于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL質量濃度為5%的亞硝酸鈉，后續操作見標準曲線的繪制所述，根據標準曲線計算樣品中黃酮的含量，結果以mg/mL表示。

1.3.4 多糖含量測定

1.3.4.1 總糖含量測定

總糖含量使用蒽酮-硫酸法進行測定[23]。

標準曲線制作：取0.2 g蒽酮，將其倒入100 mL體積分數為80%的硫酸中，制得蒽酮試劑[24]。準確稱取烘干至恒重的葡萄糖50 mg，取水補至50 mL，量取10 mL移至100 mL容量瓶，定容即得0.1 mg/mL葡萄糖溶液。 分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 至試管，在冰浴條件下加入4 mL蒽酮試劑，加水定容至5 mL。沸水浴中煮沸10 min，冷卻至25℃后在620 nm下測定吸光度。橫坐標為吸光度值、縱坐標為葡萄糖濃度（mg/mL），得標準曲線：y=0.016 4x+0.000 2，R2=0.998 2。

樣品總糖含量測定：準確量取1.0 mL樣品至試管，在冰浴條件下加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴中煮沸10 min，冷卻至25℃后在620 nm下測定吸光度。根據標準曲線計算樣品中總糖含量，結果以mg/mL表示。

1.3.4.2 還原糖含量測定

還原糖標準曲線制作[25]：準確稱取1 g標準葡萄糖，將其加入到1 000 mL蒸餾水中，得到濃度為1 g/L的葡萄糖標準液。取7支25 mL刻度試管，按1號至7號編號，分別量取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖標準液至其中， 再分別加入 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL蒸餾水，之后每個試管內均加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻之后在沸水浴的條件下加熱5 min，取出之后立刻將其放入冷水中，待其冷卻至25℃之后，再用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。在540 nm波長下，用1號管作為參比調零，測定溶液的吸光度值[26]。橫坐標為吸光度值、縱坐標為葡萄糖濃度（mg/mL），得標準曲線：y=0.0835x+0.0014，R2=0.9974。

樣品還原糖含量測定：取25 mL刻度試管，準確量取2 mL稀釋了100倍的樣品和1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，按照與制作標準曲線相同的方法操作。測定各管中溶液的吸光度值，根據標準曲線計算出還原糖含量[27]。

1.3.4.3 多糖含量測定

1.3.5 甜菜堿含量測定

枸杞甜菜堿含量測定[28]：稱取10 mL樣品于50 mL離心管中，以4 000 r/min離心4 min，過濾。吸取濾液5 mL，將其加入到已活化的Waters Oasis MCX固相萃取小柱中，需要同時控制自然流速，等待樣液進入萃取小柱的吸附層后，依次使用5 mL 80%甲醇溶液、5 mL甲醇對其進行淋洗,最后用5 mL氨化甲醇進行洗脫，并重復洗脫一次[29]。將收集的洗脫液氮吹濃縮，使其接近干的狀態，之后用2 mL乙腈溶液溶解定容，經0.45 μm濾膜過濾，待測定。

標準曲線制作：配制 0.000、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000 mg/L 標準工作液，經0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進行測定，外標法定量。以甜菜堿濃度x（mg/L）為橫坐標，峰面積y為縱坐標繪制標準曲線,得標準曲線：y=2×106x+336 433，R2=0.979 1。

樣品測定：色譜柱Atlantis HILIC（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 乙腈-水；流速 1.0 mL/min；柱溫 25 ℃；檢測波長195 nm；進樣體積20 μL。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫流動相配比Table 1 Gradient elution mobile phase ratio

1.3.6 香氣成分測定

頂空固相微萃取[30]：準確稱取5.0 g樣品至15 mL頂空瓶中，加入1.00 g NaCl和800 μL 0.4 mg/mL環己酮，加蓋密封。使用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）萃取頭（50/30 μm DVB/PDMS）在 40 ℃頂空萃取30 min，將萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）儀進樣口，解吸 5 min。

氣相色譜條件：DB-LMS石英毛細柱（60 m×0.25 mm×0.25 mm）；初始溫度為40℃，保持該溫度3 min，以4℃/min的速度上升到120℃，再以6℃/min的速度上升到240℃，保持該溫度9 min。載氣為氦氣，進樣口溫度250℃，分流進樣，分流比為10。

質譜條件：接口溫度230℃；電子能量70 eV；放射電流150 μA；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；質子掃描范圍35 aum～500 aum[31]。

1.4 數據處理與分析

采用Origin軟件進行數據分析和繪圖，每組試驗均重復3次，結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒色澤的影響

浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒色澤的影響如圖1所示。

dL*值反映樣品的亮度變化，da*值反映樣品的紅/綠變化，db*值反映樣品的黃/藍變化。由圖1（A）可知隨著時間的延長，3種酒度的浸提酒dL*值先急劇下降，后呈平穩趨勢，說明浸提酒的亮度先減小，后基本不變。由圖1（B）、（C）可知隨著時間的延長，da*值在5 d內迅速下降，10 d之后42% vol、45% vol酒da*值呈上升趨勢，53% vol酒da*值呈下降趨勢而db*值先快速上升后緩慢上升，說明浸提酒的顏色逐漸趨于紅黃色，但在5 d～25 d內，浸提酒顏色變化不明顯。枸杞浸提酒色澤的變化是因為隨著浸提時間的延長，枸杞中的成分伴隨著細胞的破裂溶解到酒中。

圖1 不同酒度枸杞酒浸提不同時間的dL*、da*、db*值Fig.1 dL*，da*，db*value of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction

2.2 浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒黃酮含量的影響

浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒黃酮含量的影響如表2所示。

由表2可知，42% vol和45% vol酒在浸提到第5天時黃酮含量達到最高，分別為0.051、0.049 mg/mL，之后隨著浸提時間的延長含量基本不變，而53% vol酒在浸提到第15天時黃酮含量達到最高，最高含量為0.039 mg/mL。這是因為隨著浸提時間的延長，黃酮的溶解量增加，最后含量基本保持不變。

表2 不同酒度枸杞酒浸提不同時間的黃酮含量Table 2 Flavonoids content of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

2.3 浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒多糖含量的影響

浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒多糖含量的影響如表3所示。

表3 不同酒度枸杞酒浸提不同時間的總糖、還原糖、多糖含量Table 3 The content of total sugar,reducing sugar and polysaccharide of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

由表3可以看出42% vol枸杞酒中的枸杞多糖隨著浸提時間的延長逐漸增加且增加量較為明顯，從第5天的8.75 mg/mL增加到第25天的21.99 mg/mL，這可能是隨著浸提時間的延長,加快了細胞的破裂,從而使多糖更好地溶解到水中，使枸杞多糖含量升高[32]。45% vol、53% vol枸杞酒中的枸杞多糖含量分別在第10天、第20天達到最大值7.89、5.83 mg/mL，而隨著浸提時間的進一步延長，多糖含量稍有降低，這可能是多糖的結構發生變化，使多糖含量降低[32]。

2.4 浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒甜菜堿含量的影響

浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒甜菜堿含量的影響如表4所示。

由表4可知，42% vol酒中甜菜堿的含量隨著浸提時間的增加而不斷增大，在第25天有最大值1.904 mg/L，這可能是隨著浸提時間增加，甜菜堿的溶出量不斷升高，導致其含量逐漸升高。45% vol酒和53% vol酒中甜菜堿含量在第10天時分別達到最大值3.070、2.095mg/L，之后隨著浸提時間的延長，甜菜堿含量逐漸下降。

表4 不同酒度枸杞酒浸提不同時間的甜菜堿含量Table 4 Betaine content of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

2.5 浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒香氣成分的影響

浸提時間對不同酒度枸杞浸提酒香氣成分的影響如表5所示。

表5 不同酒度枸杞酒浸提不同時間的香氣成分含量Table 5 The content of aroma components of Lycium barbarum wine with different degrees of alcohol extraction at different times

由表5可知，42% vol浸提酒共檢測出28種香氣成分，包括1種醛類，4種醇類，19種酯類，4種酮類，其中典型香氣成分為辛酸乙酯，其含量在第10天時達到最大值即1.608 mg/mL；45% vol浸提酒共檢測出25種香氣成分，包括1種醛類，3種醇類，19種酯類，2種酮類，典型香氣成分也為辛酸乙酯，其含量在第15天時達到最大值即1.962 mg/mL；53% vol浸提酒共檢測出21種香氣成分，包括1種醛類，3種醇類，16種酯類，1種酮類，典型香氣成分同樣為辛酸乙酯，其含量在第20天時達到最大值即2.785 mg/mL。

3 結論

不同酒度枸杞浸提酒在5 d～25 d內，色澤變化不是非常明顯，即在任意一個浸提時間，浸提酒的色澤都可以被接受。3種酒度枸杞浸提酒在25 d內黃酮含量變化很小，42% vol和45% vol酒的黃酮含量在第5天達到最大值，53% vol酒的黃酮含量在15 d達到最大值。對于枸杞多糖的研究表明，42% vol酒中的枸杞多糖隨著浸提時間的增加呈上升趨勢，在第25天達到最大值，45% vol、53% vol酒的枸杞多糖含量分別在第10天、第15天達到最大值。對于甜菜堿含量來說，42% vol酒中甜菜堿的含量隨著浸提時間增長不斷升高，在第25天有最大值，而45% vol酒和53% vol酒中甜菜堿含量在第10天時達到最大值。此外，對3種酒度枸杞浸提酒的香氣成分研究表明，典型香氣成分均為辛酸乙酯，且 42% vol、45% vol、53% vol酒中辛酸乙酯的含量分別在第10、15、20天達到最大值。綜合考慮得出42% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時間為10 d，45% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時間為10 d，53% vol枸杞浸提酒的枸杞最佳浸提時間為20 d。本研究為不同酒度枸杞浸提酒的開發提供了一定的理論參考。