米胚油提取物對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影響

徐文杰，趙錦錦

（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇常州213000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130000）

稻谷是日常人們食物最主要的來源之一，近年來我國稻谷的產(chǎn)量大約為1.86億噸，稻谷作為我國最主要的糧食作物之一，產(chǎn)區(qū)遍及全國各地[1]。大米胚芽是稻谷中的重要組成部分，加工的過程中米胚隨著米皮一起脫落，是稻米加工的副產(chǎn)品，但當(dāng)前對(duì)其利用率不高而造成了資源的浪費(fèi)[2-3]。米胚是稻谷的精華所在，其營養(yǎng)價(jià)值十分豐富，富含數(shù)十種生物活性成分，是一種天然的營養(yǎng)源，可廣泛用于各種營養(yǎng)、保健食品中。米胚油中70%～80%的脂肪酸為不飽和脂肪酸，維生素E高達(dá)43 mg/100 g油脂。維生素E是一種強(qiáng)抗氧化劑，能阻止脂肪氧化，可預(yù)防過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生[4]。

眾所周知，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)可以達(dá)到緩解生活壓力、提高免疫力、調(diào)節(jié)情緒等效果，一旦過量運(yùn)動(dòng)，會(huì)致使骨骼肌疲勞，進(jìn)而損傷骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能[5-6]。骨骼肌在急性運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化劑與抗氧化劑之間平衡的狀態(tài)打破，從而引起骨骼肌疲勞、肌肉功能障礙和損傷等，使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降[7-8]。鑒于米胚油抗氧化能力較強(qiáng)，本文將采用響應(yīng)面法優(yōu)化米胚油的提取，并建立大鼠力竭運(yùn)動(dòng)模型，探討米胚油對(duì)其骨骼肌抗氧化酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

米胚：黑龍江省和糧農(nóng)業(yè)有限公司；石油醚（分析純）、乙醇（分析純）、正己烷（分析純）、異丙醇（分析純）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）：南京建成生物工程研究所。

SPF級(jí)雄性SD大鼠：廣州市旭生生物科技有限公司[SYXK（粵）2019-0045]，50 只，體重（120±5）g。

1.2 儀器與設(shè)備

TY15/ZX1003型電子天平：北京海富達(dá)科技有限公司；DJ-10A型多功能粉碎機(jī)：北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司；BK-300J型超聲波清洗機(jī)：濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；101-A2型鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海科辰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S-1-150S型高速離心機(jī)：鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋：常州金壇良友儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米胚油的提取

挑選米胚→干燥去水分→粉碎→加入溶劑→超聲提取→減壓蒸餾→干燥恒重→精煉→脫蠟→脫膠→脫酸→脫色→精制油

挑選無蟲蛀無發(fā)霉米胚，50℃干燥2 h，去除水分，之后粉碎至粒徑為0.15 mm，得到米胚粉末。稱取適量的米胚粉末，放置于磨口三角瓶中，加入一定量的提取溶劑，放置于超聲波清洗器中，在一定超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間下進(jìn)行浸提，提取結(jié)束后，減壓蒸餾出溶劑，并在50℃下干燥至恒重得到米胚油。

式中：Y 為米胚油提取率，%；m1米胚油質(zhì)量，g；m2磨口三角瓶質(zhì)量，g；M為米胚粉質(zhì)量，g。

1.3.2 米胚油精煉

1）脫蠟：將米胚油放入恒溫冰箱（4℃左右），使蠟結(jié)晶16 h析出，離心分離得到脫蠟米胚油。

2）脫膠：使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%磷酸，在80℃下先加入占油質(zhì)量比0.2%的磷酸攪拌2 min，再加入適量水（加水量為膠質(zhì)含量的大約3倍）攪拌，采用高溫水化法進(jìn)行水化脫膠。

3）脫酸：加入濃度為15%的KOH，并不斷攪拌，保證混合均勻，當(dāng)油脂出現(xiàn)沉降時(shí)，停止攪拌，將其移入到離心機(jī)中分離得到油。

4）脫色：加入活性白土脫色（用量為油脂量的5%左右），過濾得到米胚油的精制油脂。

1.4 單因素試驗(yàn)

設(shè)定不同液料比 3∶1、6∶1、9∶1、12:1、15∶1（mL/g）；設(shè)定不同提取溫度 30、40、50、60、70 ℃；設(shè)定不同提取時(shí)間 10、20、30、40、50 min； 設(shè)定不同超聲功率 100、120、140、160、180 W，考察各因素對(duì)米胚油提取率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化米胚油提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以米胚油提取率（Y）為指標(biāo)，選擇液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）、超聲功率（X4）為因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Box Behnken design factor level

1.6 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

選取SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體重在（120±5）g，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境室溫22℃～24℃。隨機(jī)分成5組，每個(gè)小組10只大鼠，分別為對(duì)照組、力竭運(yùn)動(dòng)組、米胚油低、中、高劑量組。米胚油低、中、高劑量組每天灌胃50、100、200 mg/kg米胚油，力竭運(yùn)動(dòng)組灌胃100 mg/kg生理鹽水。其中對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)，其它4組進(jìn)行游泳訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)時(shí)間持續(xù)5周。將大鼠放入到游泳池內(nèi)，大鼠的尾部負(fù)重其體重5%的鉛絲，從大鼠進(jìn)入到游泳池開始，到大鼠力竭的這段周期，沉入水中10 s不能浮到水面停止實(shí)驗(yàn)。大鼠在5周實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，立即動(dòng)物處死，并且迅速取出股四頭肌，浸入生理鹽水洗凈殘余血液，剪取大約1 g左右組織按照料液比為1∶9（g/mL），加入事先預(yù)冷的pH7.2的Na2HPO4緩沖液，勻漿后3 000 r/min離心20 min，取上清液并對(duì)相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA、GSH-Px等指標(biāo)根據(jù)酶學(xué)試劑盒的說明書檢測分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采取組間進(jìn)行對(duì)比，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)米胚油提取率的影響

以米胚油提取率為指標(biāo)，考察4種溶劑對(duì)提取率的影響，篩選出適合本試驗(yàn)的提取溶劑，在相同條件下，加入相同液料比的提取溶劑，提取溶劑對(duì)米胚油提取率的影響見圖1。

圖1 提取溶劑對(duì)米胚油提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of rice germ oil

由圖1可知，相比于其它3種溶劑，正己烷對(duì)米胚油的提取效果最佳，提取的油脂最多，所以選擇正己烷作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)米胚油提取率的影響

液料比對(duì)米胚油提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對(duì)米胚油提取率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of rice germ oil

由圖2得出，隨著溶劑的增加，米胚油提取率越來越高，當(dāng)液料比為 12∶1（mL/g）時(shí)，提取率增加趨勢不再明顯。液料比越大越有利于油脂的提取，但是達(dá)到飽和之后，提取率升高趨勢不明顯，繼續(xù)增大液料比會(huì)使油脂與溶劑的分離時(shí)間變長，導(dǎo)致成本的提高。 故選擇12∶1（mL/g）為最佳提取液料比。

2.2.2 提取溫度對(duì)米胚油提取率的影響

提取溫度對(duì)米胚油提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)米胚油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of rice germ oil

由圖3得出，隨著提取溫度的增加，米胚油提取率逐漸增高，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，提高率達(dá)到最高，繼續(xù)提高溫度，提取率出現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，油脂更容易被萃取到提取溶劑中，同時(shí)過高的溫度會(huì)使得米胚內(nèi)其它物質(zhì)析出，影響提取率。故選擇50℃為最佳提取溫度。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)米胚油提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)米胚油提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)米胚油提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of rice germ oil

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，米胚油提取率隨提取時(shí)間的延長而逐漸增大，在提取時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)延長時(shí)間提取率出現(xiàn)降低趨勢。這是因?yàn)樵诔暱栈茐牡臈l件下，延長時(shí)間有利于油脂溶出。因此，選擇40 min為最佳提取時(shí)間。

2.2.4 超聲功率對(duì)米胚油提取率的影響

超聲功率對(duì)米胚油提取率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對(duì)米胚油提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of rice germ oil

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，米胚油提取率隨超聲功率的增加而逐漸增加，在超聲功率為140 W時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)增加超聲功率提取率出現(xiàn)降低趨勢。超聲功率的增加使得超聲強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)而空化作用加強(qiáng)，從而使米胚內(nèi)的細(xì)胞破碎速度加快，致使油脂從物料中析出更加容易，過高的超聲功率會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)的黏度增加，從而影響提取率。故選擇140 W為最佳超聲功率。

2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以米胚油提取率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)Box-Benhnken試驗(yàn)中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box Behnken experimental design and results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Box Behnken experimental design and results

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model

利用Design-Expert軟件對(duì)表3組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：Y=83.27+1.23X1+0.66X2+1.05X3-0.72X4-0.093X1X2+0.16X1X3+0.033X1X4-0.045X2X3+0.092X2X4+0.088X3X4-1.91X12-2.11X22-2.33X32-2.47X42。

由表3分析可知，模型P=0.000 1＜0.01（極顯著），失擬項(xiàng)P=0.526 4＞0.05（不顯著），說明方程對(duì)試驗(yàn)具有較好的擬合性，試驗(yàn)誤差較小。R2=0.999 3，R2Adj=0.998 6也表明模型擬合程度較好，可用于優(yōu)化米胚油的提取工藝。

分析從各個(gè)因素的顯著性水平差異可知，對(duì)米胚油提取率影響次序?yàn)橐毫媳龋咎崛r(shí)間＞超聲功率＞提取溫度。并且液料比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率影響都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）；X1X2達(dá)到顯著水平（P＜0.05）、X1X3達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）、X2X4達(dá)到顯著水平（P＜0.05）、X3X4達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；液料比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率各因素的二次項(xiàng)對(duì)提取率影響極顯著（P＜0.01）。

采用超聲波輔助法提取米胚油的最佳工藝，當(dāng)液料比為 12.98∶1（mL/g）、提取溫度為 51.44 ℃、提取時(shí)間為42.32 min、超聲功率為137.26 W時(shí)米胚油的提取率為83.69%。考慮實(shí)際操作方便，將工藝參數(shù)調(diào)整，液料比為 13∶1（mL/g）、提取溫度為 51 ℃、提取時(shí)間為42 min、超聲功率為137 W。選取上述組合做3次平行試驗(yàn)，用來驗(yàn)證上述工藝的可行性，得出米胚油平均提取率為82.47%，與預(yù)測值接近。因此修改的工藝參數(shù)具備實(shí)用價(jià)值。

2.4 米胚油對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影響

米胚油對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影響見表4。

表4 米胚油對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影響Table 4 Effects of rice germ oil on antioxidant enzyme activities in skeletal muscle of exercise rats

由表4可知，力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠SOD水平均低于低、中、高米胚油組，其中高劑量組與力竭運(yùn)動(dòng)組相比顯著升高（P＜0.05），力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠SOD水平與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）；力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠GSH-Px水平均低于低、中、高米胚油組，其中高劑量組與力竭運(yùn)動(dòng)組相比顯著升高（P＜0.05），力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠GSHPx水平與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）；力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠MDA含量均低于低、中、高米胚油組，其中高劑量組與力竭運(yùn)動(dòng)組相比顯著降低（P＜0.05），力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠MDA含量與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）。正常情況下，機(jī)體內(nèi)有氧化和抗氧化的平衡體系，并且存在自由基防御體系，包括SOD、GSH-Px等在內(nèi)的酶促防御系統(tǒng)，可以快速地清除自由基，使機(jī)體免受危害，SOD、GSH-Px活性及MDA含量對(duì)機(jī)體組織的抗氧化水平及氧化損傷有至關(guān)重要作用[9-10]。大鼠建立力竭運(yùn)動(dòng)模型后，MDA含量明顯升高，SOD與GSH-Px活性降低，使得骨骼肌發(fā)生了氧化性損傷，使股四頭肌內(nèi)的自由基代謝加快，導(dǎo)致大量抗氧化酶被消耗，并且自由基對(duì)蛋白酶有很強(qiáng)的毒性，由于米胚油具有很強(qiáng)的抗氧化能力，激活和保護(hù)抗氧化酶系，清除自由基，使得骨骼肌組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少，減緩骨骼肌氧化性損傷，提高抗氧化酶活性。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取米胚油的最佳工藝，當(dāng)液料比為 13∶1（mL/g）、提取溫度為 51 ℃、提取時(shí)間為42 min、超聲功率為137 W，得出米胚油平均提取率為82.47%。同時(shí)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠實(shí)驗(yàn)表明：米胚油具有很強(qiáng)的抗氧化能力，激活和保護(hù)抗氧化酶系，清除自由基，使得骨骼肌組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少，減緩骨骼肌氧化性損傷，提高抗氧化酶活性。