響應面法優化厚樸花總酚浸提工藝

沈春紅，李金星，何越雯，葛苗苗，馬林，2*

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010；2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心，四川綿陽621010）

厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)，木蘭科高大喬木，首載于《神農本草經》，其味苦溫，主中風、傷寒、頭痛、寒熱[1]。歷代本草論述其主要以根皮、干皮及枝皮入藥，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯等[2]。厚樸樹皮的生長周期長，一般要15年以上才符合藥用質量要求[3]，這導致其使用效率受到限制，經濟效益低下。近年來，為提高厚樸的資源利用率，探索厚樸新用途，不少學者已經對厚樸籽、厚樸葉和厚樸花進行研究，如厚樸籽優良種源選育[4-5]；厚樸葉餐具墊片和其用作牲畜飼料、化妝品、植物殺菌劑以及食品包裝[6-7]；厚樸花化學成分研究[8-10]，這些研究拓展了厚樸新的消費方式，使厚樸資源得到進一步利用。

厚樸花是厚樸的非藥用部位，最早記載于1936年出版的《飲片新參》[11]。現代藥理學研究表明，厚樸花與厚樸皮有近似成分，如酚類、生物堿類[12]以及揮發油類[10]，且同樣具有抗炎、鎮咳、鎮痛以及促進胃排空、推進腸運動等藥理作用[13-16]。目前，僅有少量的厚樸花被用于臨床治療[17]和研制金屬納米材料[18]，大量的厚樸花任其自由凋落腐爛，造成了藥用資源的浪費。查閱資料發現，厚樸花被列于2002年版可用于保健食品的物品名單，此外，在四川平武，松潘等地方也有用厚樸花泡茶飲用的習慣，但未見對其加工利用的研究。如今，已有研究者將具有降血脂和增強免疫力功能的杜仲雄花茶[19]和潤肺止咳的枇杷花茶[20]等開發為特色植物飲品，深受消費者喜愛。若能在科學研究的基礎上對厚樸花進行提取加工，將產生重要的經濟和社會效益。

酚類物質作為厚樸皮中的主要有效成分，主要包括厚樸酚與和厚樸酚，具有抗炎、鎮痛、抗菌、抗腹瀉等多種生理功能[21-22]。因厚樸皮中酚類物質含有烯丙基的聯苯二酚結構，使其具有較強的抗氧化作用，這是厚樸中酚類物質能發揮生物學功能的重要基礎[23]。厚樸花是厚樸的一部分，其主要有效成分與厚樸皮相近。本試驗以厚樸花總酚含量為響應值，通過單因素試驗、篩選試驗設計（plackett-burman，PB）、最陡爬坡試驗和響應面試驗，探索厚樸花最佳浸提工藝條件，為實現厚樸花保健茶的開發探索道路，也將有利于厚樸資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

厚樸（Magnolia officinalis）花：于2019年5月采自四川省松潘縣白羊鄉；福林酚、碳酸鈉（分析純）：成都科隆化學試劑有限公司。

JY2003電子天平：賽多利斯科儀器（北京）有限公司；DHG-9053A電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；UV-8000S紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫療儀器有限公司；SL-200型高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

固定厚樸花粉碎度為80目、提取溫度100℃、提取時間 10 min、提取 1 次，考察不同料液比 [1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]對厚樸花總酚含量的影響，篩選出最佳料液比，然后將其作為最佳加條件固定，再分別考察提取時間（3、5、7、9、11、13、15min）、提取溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）、提取次數（1、2、3）和粉碎度（20、40、60、80、100、120 目）。 其中，對于特定時間內溫度的保持，采用水浴鍋保溫來實現。每次改變一個因素，考察完一個因素后，將其最佳條件作為下一個因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗。

1.2.2 篩選試驗設計（plackett-burman design，PB）

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert 10.0.7軟件進行PB試驗設計，對料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、粉碎度（D）進行分析，采用4個因素和7個虛擬因素進行N=12的設計組合，以總酚含量為響應值，試驗設計見表1。

表1 PB設計因素及水平Table 1 Plackett－burman design factor level

1.2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是根據PB試驗的結果，對篩選出的顯著因素進行設計，根?據各因素的效應大小和變化方向確定爬坡步長和方向[24]。根據PB試驗的結果，選擇對厚樸花總酚含量有顯著影響的因素作為響應面試驗的中心點開展試驗，由此逼近最大響應值區域。

1.2.4 響應面試驗

根據響應面試驗設計（Box-Behnken design，BBD）原理，在PB試驗和最陡爬坡試驗結果的基礎上，選擇料液比（X1）、提取溫度（X2）、粉碎度（X3）3 個因素，建立三因素三水平數學模型對厚樸花浸提工藝進行優化，其余因素條件固定為提取時間7 min，提取1次，試驗設計見表2。

表2 響應面因素與水平Table 2 Response surface factors and horizontal table

1.2.5 總酚含量的測定

采用Folin-酚比色法[25]，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.269 1X+0.057 9（R2=0.999 6）。取30 μL厚樸花浸提液加入10 mL的比色管中，加入5 mL 10%福林酚顯色劑，搖勻，8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉，定容，混勻。靜置60 min后，在765 nm波長下測定吸光度。總酚含量以每克厚樸花茶中沒食子酸含量計。

1.3 數據處理

所有測定均重復3次，取平均值，用SPSS 22.0進行顯著性分析，采用Origin 9.0繪圖；PB試驗和響應面試驗設計及分析采用Design Expert 10.0.7。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對厚樸花總酚含量釋放的影響

固定厚樸花粉碎度為80目、提取溫度100℃、提取時間10 min、提取1次，料液比對厚樸花總酚含量的影響見圖1。

圖1 料液比對厚樸花總酚含量的影響Fig.1 Effect of material liquid ratio on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖1可知，厚樸花總酚含量總體隨著溶劑的增加而增加，料液比超過1∶30（g/mL）時增長速率變緩。溶劑添加量較小時，溶劑不足以完全提取出厚樸花粉末中的總酚，這在一定程度上降低了總酚的溶出率；而溶劑添加量過大時，由于傳質阻力，過量的水不再起到提取總酚的作用，反而降低溶液的總酚濃度[26]。從節約成本的角度出發，考慮料液比1∶30（g/mL）為最佳。

2.1.2 提取時間對厚樸花總酚含量的影響

用料液比1∶30（g/mL）提取厚樸花茶，固定粉碎度為80目、提取溫度100℃浸提1次，提取時間對厚樸花總酚含量的影響見圖2。

由圖2可知，厚樸花總酚含量總體隨著提取時間的延長而升高，在浸提時間為7 min時出現拐點（5.64%），9 min～15 min范圍內又波動上升。一般來說總酚含量隨著提取時間的延長而增加，但在實際操作時，處于高溫條件下的時間越長，總酚越易發生氧化聚合反應，導致品質下降[27]。因此在工業提取厚樸花時，應對提取時間進行合理的控制以得到高品質的浸出物。故提取時間選擇7 min為宜。

圖2 提取時間對厚樸花總酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

2.1.3 提取溫度對厚樸花總酚含量釋放的影響

按照料液比 1∶30（g/mL）、粉碎度 80 目、提取時間7 min、對厚樸花進行1次提取，提取溫度對厚樸花總酚含量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對厚樸花茶總酚含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖3可得，厚樸花總酚含量隨著提取溫度的升高而增加，在70℃～90℃之間增速最快，之后趨于穩定，90℃與100℃無顯著性差異（P＜0.05）。這可能是由于較高的提取溫度有利于厚樸花茶中總酚向溶劑迅速擴散，在90℃時植物總酚已基本溶出，再升高提取溫度，植物中酚類物質發生氧化聚合更加明顯，其含量不再增加[28]。此外，繼續增高溫度會延長升溫時間，消耗能源，造成成本增加，因此選擇提取溫度為90℃。

2.1.4 提取次數對厚樸花總酚含量釋放的影響

以料液比 1∶30（g/mL）、粉碎度 80 目、90 ℃溫度對厚樸花提取7 min，提取次數對厚樸花總酚含量的影響見圖4。

圖4 提取次數對厚樸花茶總酚含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖4可知，隨著提取次數的增加，厚樸花總酚含量不斷降低。本試驗中提取2次與提取1次出現顯著差異（P＜0.05），多次提取將增加功率的消耗，從節能角度考慮本試驗選擇浸提1次。

2.1.5 粉碎度對厚樸花總酚含量釋放的影響

對厚樸花茶進行1次提取，固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃提取7 min，粉碎度對厚樸花總酚含量的影響見圖5。

圖5 粉碎度對厚樸花總酚含量的影響Fig.5 Effect of raw material particle size on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖5可知，總酚含量隨著厚樸花粉碎度的增大而增大，80 目時達到最高值（5.68%），但 60、80、100、120目之間總酚含量沒有顯著差異（P＜0.05）。對水溶性成分而言，原料顆粒越小，其與水的接觸面積越大，水溶出物越多。粉碎度為20目～40目時，原料顆粒較大，厚樸花粉末與水的接觸面積小，導致總酚不能完全溶出；隨著粉碎度增加到100目～120目時，原料顆粒間的吸附作用增強，總酚含量不再增加，且粉碎功率消耗變大，成本提高，此外，粉末易懸浮于水中使溶液渾濁，因此選擇粉碎度為60目。

2.2 PB試驗設計結果

PB試驗可以有效地篩選出影響厚樸花總酚溶出率的關鍵因素，其設計與結果見表3。各因素的PB試驗結果回歸分析見表4。

表3 PB設計及結果Table 3 Plackett-burman design and results

表4 PB試驗結果回歸分析Table 4 Regression analysis of plackett-burman experimental results

由表4可知，此回歸模型的P值為0.004 6，小于0.01，表明回歸模型具有統計學意義，同時決定系數R2=0.992 0，調整決定系數為0.970 8，說明模型設計可靠。此外，各因素的P值表明，各因素對厚樸花總酚含量的影響水平為粉碎度＞提取溫度＞料液比＞提取時間，其中粉碎度、料液比和提取溫度達到極顯著水平（P＜0.01）。相關性方程為：總酚含量/%=-1.269 77+0.032 883A+0.091 603B+0.034 567C+0.027 909D+0.136 42F-0.102 52H-0.200 53J-0.278 70L。

由方程可知，粉碎度、料液比、提取溫度和提取時間4個因素均為正效應。根據各因素影響水平選擇粉碎度、料液比和提取溫度3個因素進行最陡爬坡試驗，提取時間和提取次數選擇單因素試驗的最佳條件。

2.3 最陡爬坡試驗設計結果

由PB試驗得出粉碎度、料液比和提取溫度均為正效應，由此確定爬坡方向和合理步長。最陡爬坡試驗中X1料液比、X2提取溫度和X3粉碎度對厚樸花總酚含量的影響見表5。

由表5可知，試驗3組厚樸花的總酚含量最高，故選擇試驗組3作為Box-Behnken試驗的中心值，并以2組和4組試驗條件為邊界，優化下一步的響應面試驗。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Test design and results of steepest climb

2.4 Box-Behnken試驗設計結果及方差分析

在PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎上利用Design Expert 10.0.7軟件進行響應面試驗設計，得到試驗結果見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Box-Behnken design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

對試驗結果進行多元回歸擬合，得到變量（料液比X1、提取溫度X2、粉碎度X3）與響應值厚樸花總酚含量之間的回歸模型方程：厚樸花總酚含量/%=-118.71406-0.067 588X1+2.702 69X2-2.921 71×10-3X3+6.143 37×10-3X1X2+1.180 94×10-3X1X3+1.124 32×10-3X2X3-8.580 66×10-3X12-0.016 232X22-6.868 35×10-4X32。

由表7可知，模型P值小于0.001，模型極顯著，失擬項P值為0.179 2，無顯著性差異，R2=0.967 8，表明模型對本試驗擬合程度良好，R2Adj=0.926 4，表明該模型能解釋92.64%響應值的變化，模型變異系數C.V=2.62%＜10%，進一步說明該模型較為穩定，重復性好，因此可用該回歸方程對不同提取工藝條件下厚樸花總酚含量進行分析預測。影響厚樸花總酚含量的因素順序為粉碎度（X3）＞料液比（X1）＞提取溫度（X2）。 回歸模型中二次項X12和 X32顯著（P＜0.05），X22極顯著（P＜0.01），而一次項 X1X2、X1X3和 X2X3均不顯著（P＞0.05），表明不同提取條件對厚樸花總酚含量的影響不同。

對響應面試驗結果進行分析，得到各因素交互作用對厚樸花總酚含量影響響應面圖，見圖6。

從圖6可知兩兩因素之間交互作用的響應面圖都較為平緩，表明各因素之間的交互作用不顯著；總酚含量與料液比的曲線較提取溫度與總酚含量的曲線陡，說明料液比對厚樸花總酚含量的影響較提取溫度高；粉碎度與總酚含量的曲線較料液比陡，說明粉碎度對厚樸花總酚含量的影響大于料液比；同理可得，粉碎度對厚樸花總酚含量的影響大于提取溫度，與方差分析結果相符。

圖6 各因素交互作用對厚樸花總酚含量影響的響應面與等高線Fig.6 Contour plots and response surface diagram showing the interaction effect of various factors on the Magnolia officinalis flower

2.5 最佳提取條件的確定與驗證試驗

通過Design Expert 10.0.7軟件分析得出厚樸花總酚含量最高的工藝條件：料液比 1∶30.78（g/mL）、提取溫度94.22℃、粉碎度98.67目、提取時間7 min、提取次數1次，在此條件下，預測的總酚含量為6.50%。考慮到實際操作的可行性，將理論工藝條件調整為料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度 94 ℃、粉碎度 100 目、提取時間7 min、提取1次，平行試驗3次，得到厚樸花總酚含量為6.42%，與模型預測結果相近，表明此模型用于預測厚樸花的浸提工藝條件具有較高可靠性。

3 結論

本試驗以厚樸花總酚含量為響應值，通過單因素試驗、PB試驗、最陡爬坡試驗和響應面試驗確定了厚樸花最優水提工藝條件為料液比1∶30（g/mL）、提取溫度94℃、粉碎度100目、提取時間7 min、提取1次，此時的總酚含量為6.42%。較高的粉碎度有利于顆粒中總酚的溶出，提取溫度越高，溶劑中總酚含量溶出越多，但提取時間不宜過長，以7 min為佳。研究還發現，隨著提取次數的增加，溶劑中的總酚含量下降顯著，表明此厚樸花沒有多次提取的必要。本研究提供了厚樸花的最佳水提工藝，為厚樸花保健茶的研發提供了技術參考，豐富了厚樸花的消費形式，提高了厚樸副產物的附加值。