酶法輔助提取信陽(yáng)毛尖香氣成分

陳玲，王學(xué)方，李智寧，范毅，寧二娟，李健，李曉

（河南省科學(xué)院河南省生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，河南省納普生物技術(shù)有限公司，河南鄭州450008）

1 材料與方法

1.1 材料

信陽(yáng)毛尖：信陽(yáng)市浉河區(qū)青云茶葉專(zhuān)業(yè)合作社提供；β-葡萄糖苷酶（≥200U/g）、果膠酶（≥60000U/mL）、纖維素酶（≥11 000 U/g）、中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：夏勝生物科技開(kāi)發(fā)有限公司。癸酸乙酯（純度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS QP2010Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；同時(shí)蒸餾萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE） 提取器、HH-4Y電熱恒溫水浴鍋：上海啟前電子科技有限公司；SHSL調(diào)溫電熱套：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會(huì)社；ME204電子分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；SANYO醫(yī)用低溫箱：日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析條件

GC 條件：Rxi-5MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛細(xì)管柱。 進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為He氣，柱流量為1.5 mL/min，升溫程序：初始溫度為100℃，先以10℃/min升至260℃，再以20℃/min升溫至300℃（保持 10 min），分流比 5∶1。

MS條件：離子源為電子轟擊電離源（EI），離子化電壓70 eV，離子源溫度250℃，質(zhì)譜掃描范圍40 amu～500 amu，檢測(cè)器電壓0.88 kV。

1.3.2 提取制備方法

β-葡萄糖苷酶輔助提取香氣成分：綠茶粉碎，過(guò)40目篩，取20 g，置于圓底燒瓶中，加200 g蒸餾水，加0.5%β-葡萄糖苷酶，調(diào)pH值至4.5～5.0，50℃保溫酶解1 h，加1 mL癸酸乙酯（濃度98.83 g/mL），放置于電熱套上，連接SDE裝置，另一端連接另一圓底燒瓶，燒瓶中加入30 mL二氯甲烷，放置于水浴鍋上，水浴鍋溫度設(shè)置55℃，電熱套加熱使水保持微沸，同時(shí)蒸餾萃取2 h，萃取液采用無(wú)水硫酸鈉和冷凍結(jié)合除水，然后用低溫減壓濃縮，溫度為30℃，除去溶劑，稱(chēng)重，加2 mL二氯甲烷溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾即得，樣品冷凍保存。

果膠酶、蛋白酶及纖維素酶輔助提取香氣成分處理方法同上。

開(kāi)展基于校企合作的大學(xué)生職前培訓(xùn)，高校和企業(yè)可以實(shí)現(xiàn)資源共享，使教學(xué)和企業(yè)培訓(xùn)融為一體。根據(jù)企業(yè)真實(shí)需求結(jié)合市場(chǎng)導(dǎo)向采取適當(dāng)培訓(xùn)措施和培訓(xùn)策略，可以有效增強(qiáng)職場(chǎng)綜合素質(zhì)的培養(yǎng)，提高大學(xué)生的職業(yè)能力和職業(yè)素養(yǎng)，從而切實(shí)提高就業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力，解決學(xué)生就業(yè)困境，使畢業(yè)生能快速實(shí)現(xiàn)由學(xué)生向社會(huì)人的角色轉(zhuǎn)變。基于校企合作的大學(xué)生職前培訓(xùn)作為現(xiàn)階段有效的培訓(xùn)方式，始終都要堅(jiān)持以學(xué)生為本位，從學(xué)生的切身利益出發(fā)，做好培訓(xùn)規(guī)劃。校企合作開(kāi)展職前培訓(xùn)不可一蹴而就，更不是一朝一夕就可以見(jiàn)到成效的，需要高校、企業(yè)、政府和社會(huì)的共同努力。

空白為不加酶，不經(jīng)過(guò)酶解，其它步驟同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：利用NIST 2014譜庫(kù)和保留時(shí)間、保留指數(shù)對(duì)所得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索定性，挑選出匹配度大于等于80%的峰號(hào)；根據(jù)分子質(zhì)量、化學(xué)式以及分子結(jié)構(gòu)確定各個(gè)出峰物質(zhì)的名稱(chēng)。

定量分析：根據(jù)各組分色譜峰面積占樣品總峰面積（不含癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)）的含量進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶輔助提取的香氣成分

采用不同的酶分別對(duì)信陽(yáng)毛尖進(jìn)行酶解，然后采用SDE法提取其香氣成分，提取液經(jīng)過(guò)除水，30℃低溫減壓蒸干，稱(chēng)重，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同酶輔助提取的香氣成分得率Table 1 The yield of aroma components extracted by different enzymes

由表1看出，β-葡萄糖苷酶輔助提取信陽(yáng)毛尖香氣成分得率最高，其次是中性蛋白酶，果膠酶和纖維素酶輔助提取的香氣成分得率低于空白對(duì)照。

2.2 不同酶輔助提取的香氣成分比較

用β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶分別對(duì)信陽(yáng)毛尖進(jìn)行酶解，采用不加酶提取作為空白對(duì)照，然后采用SDE法提取其香氣成分，用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，定性和定量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對(duì)含量Table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對(duì)含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對(duì)含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

續(xù)表2 各種酶輔助提取下的香氣成分及相對(duì)含量Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes

由表2看出，5種提取方法共提取檢測(cè)出108個(gè)成分，共有成分23種。添加這4種酶后，二環(huán)己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯等綠茶中主要呈香成分[11-12]相對(duì)含量比空白提取時(shí)都有增加。

在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取時(shí)加入β-葡萄糖苷酶后，增加的主要香氣成分有：橙花醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、2，4-二叔丁基苯酚、順菖蒲烯、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮等共24個(gè)成分。其中橙花醇、茉莉酮、（Z）-己酸-3-己烯酯是信陽(yáng)毛尖中主要的呈香成分[13-15]。添加β-葡萄糖苷酶后，香葉醇、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、δ-杜松烯、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯等相對(duì)含量比空白提取時(shí)都有提高。信陽(yáng)毛尖中主要呈香成分[13-15]香葉醇、反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對(duì)含量與空白相比分別提高了19.5%、30.0%、81%、91.3%，香葉醇的含量?jī)H在添加β-葡萄糖苷酶時(shí)有增加，這與β-葡萄糖苷酶能水解茶葉中的糖苷鍵，釋放香葉醇的結(jié)果一致[16-17]。

在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取時(shí)加入果膠酶后，增加的主要香氣成分有：（Z，E）-金合歡醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、丙位癸內(nèi)酯、α-法尼烯、順菖蒲烯、降植烷、反式金合歡醇等共31種，消失了18種香氣成分，大部分是酯類(lèi)和烷烴類(lèi)。信陽(yáng)毛尖中主要呈香成分有：反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對(duì)含量與空白相比分別提高了8.2%、49.0%、65.2%。

在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取時(shí)加入中性蛋白酶后，增加的主要香氣成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、香葉基芳樟醇、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、順菖蒲烯、Naphthalene等共37種。芳樟醇類(lèi)化合物是信陽(yáng)毛尖中的主要呈香成分和相對(duì)含量較高的成分[18-19]，香葉基芳樟醇僅在添加中性蛋白酶后含量有所增加，這可能和本試驗(yàn)選取的材料中芳樟醇類(lèi)化合物含量低有關(guān)，但也說(shuō)明了添加中性蛋白酶后可以輔助芳樟醇類(lèi)化合物溶出。信陽(yáng)毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯，相對(duì)含量與空白相比分別提高了11.3%、63.0%、47.8%。

在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取時(shí)加入纖維素酶后共測(cè)得香氣成分62個(gè)，增加的主要香氣成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、順菖蒲烯、降植烷、反式金合歡醇等共31種。信陽(yáng)毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、鄰苯二甲酸二異丁酯的相對(duì)含量和空白對(duì)比分別提高了16.7%、65.0%、100%。

2.3 香氣成分構(gòu)成分析

各香氣成分構(gòu)成分析見(jiàn)表3。

由表2和表3看出，添加β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶后香氣成分總數(shù)較空白都有增加，其中添加中性蛋白酶后增加的香氣成分最多，增加了36.7%；添加了4種酶后，醇類(lèi)、酸類(lèi)、萜烯類(lèi)、酮類(lèi)、烷烴類(lèi)及其它類(lèi)香氣成分相對(duì)含量較空白也有一定增加，但是酯類(lèi)成分的相對(duì)含量降低很多，酯類(lèi)成分個(gè)數(shù)降低卻不明顯，這可能和添加酶后，植醇的相對(duì)含量大量增加有關(guān)。植醇是葉綠素的一個(gè)側(cè)鏈，喬克威等[20]研究采用葉綠素酶脫除葉綠素鏈上的植醇，效果很好。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶可能具有輔助水解葉綠素成植醇的功能。酸類(lèi)物質(zhì)大多呈現(xiàn)不愉悅氣味，不利于茶葉香氣品質(zhì)，添加4種酶后，酸類(lèi)成分都有增加，這可能是和酶能輔助水解部分酯類(lèi)有關(guān)。

表3 香氣種類(lèi)分析Table 3 Analysis of aroma types

3 結(jié)論

在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取過(guò)程中，添加β-葡萄糖苷酶、果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶，都能提高信陽(yáng)毛尖中的香氣成分種類(lèi)，其中添加中性蛋白酶后香氣成分種類(lèi)增加最多，綠茶中的主要香氣成分二環(huán)己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-異雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-蓽澄茄醇、植烷、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、葉綠醇的相對(duì)含量都有提高。β-葡萄糖苷酶輔助提取信陽(yáng)毛尖香氣成分得率最高，其次是中性蛋白酶。因此在信陽(yáng)毛尖香氣成分提取時(shí)添加β-葡萄糖苷酶和中性蛋白酶，既可以增加香氣成分種類(lèi)，又可以提高香氣成分得率。