婺源皇菊總黃酮的超聲輔助水提工藝及抗氧化活性

饒桂維，邵麗林，童建穎

（浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江杭州310015）

婺源皇菊，又稱曉起皇菊。該菊花嗅之芬芳，余味甘甜，因其具有消解暑氣、凝神養目等優良功效而廣受歡迎。皇菊所含有活性物質主要是黃酮類[1]、菊花多糖[2]、揮發油類[3]、水溶性色素[4]等。而對其化學成分及功效的研究大多基于金絲皇菊[5]，婺源皇菊黃酮提取工藝優化及抗氧化活性仍缺乏相關研究。

植物黃酮的提取方法眾多。楚紅英等[6]采用乙醇溶劑法對菊花中總黃酮進行了提取研究；鐘姣姣等[7]采用超聲波輔助醇浸提法對菊花中總黃酮進行了提取研究；聶健[8]采用水浸提法對骨碎補中總黃酮進行了提取研究；翟碩莉等[9]采用超聲波輔助水浸提法對苦菜中黃酮進行了提取研究。超聲輔助水浸提法提取婺源皇菊黃酮還未見報道。乙醇提取雖然得率相對較高，但在提取過程中醇溶性蛋白質、油脂等雜質析出量大；選用水[10]作提取劑，安全無污染，且比醇提法節約成本；而超聲波輔助提取法高效節能。本研究擬采用超聲輔助水浸提法提取婺源皇菊總黃酮，利用NaNO2-Al（NO）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量，通過單因素試驗和響應面法對提取工藝參數進行優化和分析，同時研究婺源皇菊總黃酮的抗氧化活性，旨在為婺源皇菊黃酮的開發和應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制婺源皇菊：采自婺源縣江灣鎮曉起村，用粉碎機粉碎成粉狀，放置在陰涼干燥處待用。

蘆丁：浙江樹人大學生物與環境工程學院實驗自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海麥克林生化科技有限公司；無水甲醇、30%過氧化氫：上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇、水楊酸：天津市永大化學試劑有限公司；L-抗壞血酸（VC）、亞硝酸鈉：成都市科龍化工試劑廠；硝酸鋁：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉：杭州蕭山化學試劑廠；硫酸亞鐵：衢州巨化試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉：廣州市金華大化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉：湖州湖試化學試劑有限公司；焦性沒食子酸（鄰苯三酚）：上海展云化工有限公司；鹽酸：華東醫藥有限股份公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YP502N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；L6S紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；KQ5200DE數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；750T多功能粉碎機：鉑歐五金廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線法測定總黃酮含量

采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH顯色法，根據杜鵑等[11]的方法進行顯色液的配制以及繪制標準曲線，修改如下，采用蘆丁（0.2 mg/mL）為標準品溶液，在510 nm波長處測定吸光度值，標準曲線的橫坐標為蘆丁濃度（C），縱坐標為吸光度值（A）。通過對標準曲線進行最小二乘法回歸可以得到線性方程：A=0.009 5C+0.023 8，r2=0.997 7。線性范圍 0～0.1 mg/mL。

1.3.2 皇菊總黃酮提取液的制備

根據王佳妮等[12]的方法，修改如下：取適量婺源皇菊樣品于三角瓶中，在室溫25℃條件下，以蒸餾水為溶劑，按一定的液料比混合均勻，在一定的超聲波時間和超聲波功率的條件下提取皇菊總黃酮，經過濾得到的濾液即為皇菊總黃酮提取液。

1.3.3 提取液中總黃酮含量的測定

精密移取0.2 mL提取液，置于10 mL比色管中，以不加提取液為空白，后續操作與“1.3.1”相同，測定吸光度，參照標準曲線計算含量。

1.3.4 總黃酮得率的計算

式中：c為總黃酮得率，%；m1為皇菊總黃酮提取液的總黃酮質量，g；m2為皇菊原料的質量，g。

1.3.5 單因素試驗

精確稱取若干份1.00 g婺源皇菊樣品，在室溫25℃下分別置于錐形瓶中，按“1.3.2”方法以如下所列的參數制備提取液，然后根據“1.3.3”測定提取液總黃酮含量，并根據“1.3.4”計算總黃酮得率。

1.3.5.1 液料比對總黃酮得率的影響

固定超聲時間為15 min，超聲功率為200 W，考察液料比[5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]對總黃酮得率的影響。

1.3.5.2 超聲時間對總黃酮得率的影響

固定液料比為1.3.5.1中最佳液料比，超聲功率為200 W，考察超聲時間（10、15、20、25、30、35、40 min）對總黃酮得率的影響。

1.3.5.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

固定液料比為1.3.5.1中最佳液料比，超聲時間為1.3.5.2中最佳超聲時間，考察超聲功率（120、140、160、180、200 W）對總黃酮得率的影響。

1.3.6 響應面試驗設計優化提取工藝

對超聲輔助水提取皇菊總黃酮進行響應面試驗設計以及回歸方程的方差分析。以總黃酮得率為響應值，液料比、超聲時間、超聲功率作為考察因素，在單因素試驗結果的基礎上，選取各個因素的3個表現較好的水平進行試驗，對試驗結果進行響應面分析，并進行重復試驗來驗證結果來確定最佳條件。試驗因素水平及編碼設計見表1。

表1 試驗因素水平及編碼設計Table 1 Levels and codes of factors of response surface experiment

1.3.7 提取液抗氧化活性測定

自由基清除反應是抑制氧化的過程之一，提取液對自由基的清除能力越強，其抗氧化活性越強。

1.3.7.1 DPPH自由基（DPPH·）清除能力

量取最佳條件下的提取液1.0 mL，根據張福欣等[13]的方法配制顯色溶液，測定溶液在517 nm波長處的吸光度值As，分別以蒸餾水和無水乙醇為空白和對照，測定吸光度值A0和Ac。同時以同濃度的VC水溶液為對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.3.7.2 OH自由基清除能力（·OH）

采用Fenton反應。量取最佳條件下的提取液1.0mL，根據張福欣等[13]的方法配制顯色溶液，測定溶液在510 nm波長處吸光度值A1。分別通過蒸餾水代替水楊酸和提取液，測定吸光度值A2和A3。同時以同濃度的VC水溶液作為對照。自由基OH清除率計算公式如下。

1.3.7.3 O2-自由基（O2-·）清除能力

采用鄰苯三酚自氧化法。量取最佳條件下的提取液2.0 mL，根據錢天元等[14]的方法配制顯色溶液，測定溶液在320 nm波長處的吸光度值A1。分別以超純水代替鄰苯三酚溶液為對照，以蒸餾水代替待測液為空白，測定吸光度值A2、A3。同時以同濃度的VC水溶液作為對照。O2-自由基清除率計算公式如下。

1.4 數據分析

Excel 2010軟件用于計算平均值、標準偏差和單因素試驗分析，Design-Expert.V8.0.6.1軟件用于響應面試驗設計與方差分析。所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對總黃酮得率影響

液料比對提取液總黃酮得率的影響結果見圖1。

圖1 液料比對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on yield of total flavonoids

由圖1可知，隨著加水量的增大，提取液總黃酮得率先上升后下降然后穩定，在總黃酮得率達到最大值時，液料比為20∶1（mL/g）。 隨著加水量的增大，黃酮更容易溶出，提取液總黃酮得率隨著加水量增大而上升；當加入的水量過多時，黃酮的結構可能會被破壞，總黃酮得率隨著水量增大而下降；當加入的水量達到一定程度后，水中溶解的黃酮的量是穩定的，總黃酮得率趨于穩定。因此選擇最佳液料比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 超聲時間對總黃酮得率的影響

超聲時間對提取液總黃酮得率的影響結果見圖2。

圖2 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，提取液總黃酮得率先上升后下降，在總黃酮得率達到最大值時，超聲時間為30min。隨著超聲時間的增加，分子運動強烈，黃酮不斷溶出，總黃酮得率上升；當超聲時間延長到一定程度時，水中溶解的總黃酮的量是穩定的；超聲時間再增加，溶解在水中的黃酮的結構可能會被破壞，總黃酮得率下降。因此選擇最佳超聲時間為30 min。

2.1.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

超聲功率對提取液總黃酮得率的影響結果見圖3。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on yield of total flavonoids

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，提取液總黃酮得率持續上升，總黃酮得率在200 W條件下達到最大值。這可能是因為超聲功率增大，提取液中黃酮分子運動增強，超聲波的空穴效應得到加強，使得黃酮不斷溶出，總黃酮得率隨著超聲功率的增加而上升。而過大的超聲功率可能會使黃酮遭到破壞，導致總黃酮得率下降。而200 W為儀器最大功率，因此選擇最佳超聲功率為200 W。

2.2 提取工藝的優化

2.2.1 響應面優化結果

根據單因素試驗的結果選取各個因素對提取液總黃酮得率較高的3個水平，設計響應面試驗，試驗方案及結果見表2。

表2 試驗方案及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

運用Design Expert.V8.0.6.1軟件，對表2中的試驗結果進行數據處理，得到方差分析表，如表3所示。

根據表3可以得到以下預測模型：Y=3.55+0.26A+0.049B+0.20C+0.026AB+0.030AC-0.078BC-0.39A2-0.11B2-0.20C2。

表3 優化后模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

模型相關系數顯示R2=0.991 9，決定系數顯示R2Adj=0.981 6，該模型沒有偏離實際情況，誤差很小。模型極顯著（P＜0.01），結果表明該模型可靠可行，可以用于預測婺源皇菊總黃酮得率。

由表3可知，整體模型達極顯著水平（P值＜0.01）,一次項A、C以及3個二次項A2、B2和C2對總黃酮得率影響均達極顯著水平，交互項BC達到顯著水平。F值的大小與各個因素對提取液總黃酮得率影響的大小有關，影響次序依次為：液料比＞超聲功率＞超聲時間。

2.2.2 響應面分析

3個考察因素影響提取液總黃酮得率的程度以及因素兩兩之間的交互作用見圖4～圖6。

圖4 液料比與超聲時間交互作用對總黃酮得率的影響Fig.4 Response of surface plots and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and ultrasonic time on yield of total flavonoids

圖5 液料比與超聲功率交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Response of surface plots and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and ultrasonic power on yield of total flavonoids

圖6 超聲時間與超聲功率交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.6 Response of surface plots and contour plots for the effect of ultrasonic time and ultrasonic power on yield of total flavonoids

考察因素影響總黃酮得率的程度可以通過響應曲面陡峭程度來反映。模型的響應曲面陡峭程度：液料比＞超聲功率＞超聲時間，表明各因素對總黃酮提取率的影響大小順序為液料比＞超聲波功率＞超聲波時間，該結論與表3模型方差分析的結論一致。

考察因素兩兩之間交互作用的強弱程度可以通過等高線的形狀來反映。如果兩因素交互影響顯著，則兩者之間交互得到的等高線圖趨于橢圓形，反之，則為圓形。由此，根據圖4～圖6可以看到，圖6中超聲時間與超聲功率交互作用的等高線圍成明顯的橢圓形狀，圖4中液料比與超聲時間交互作用的等高線近乎橢圓形，而圖5中液料比與超聲功率交互作用等高線是圓形。這也驗證了超聲時間與超聲功率交互作用顯著。

2.2.3 最佳提取工藝條件的驗證

由Design-Expert.V8.0.6.1軟件得到的分析結果，響應面優化總黃酮提取工藝的最佳條件為液料比23.54∶1（mL/g）、超聲時間 30.4 min、超聲功率 190.36 W。為方便進行試驗操作條件控制，修正最佳條件為液料比 24∶1（mL/g）、超聲時間 31 min、超聲功率 200 W。 理論總黃酮得率為3.659%。進行最佳條件驗證試驗，總黃酮得率為3.641%，與預測模型得出的理論值相比較，偏差很小，該模型可靠可行，可以用于預測提取液總黃酮得率。

2.3 抗氧化活性評價

提取液的抗氧化活性試驗結果見圖7。

圖7 提取液和VC水溶液對DPPH·、·OH、O2-·3種自由基的清除能力Fig.7 Imperial chrysanthemum watersolution and VC watersolution on DPPH·,·OH,O2-·scavenging ability

在最佳條件下（濃度約0.170mg/mL），提取液對DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分別為87.93%、51.76%、95.53%，而同濃度VC溶液對DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分別為95.80%、69.94%、81.57%。提取液對DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分別相當于同濃度下VC水溶液的91.78%、80.95%、117.10%。結果表明提取液抗氧化活性較好，與VC相近。

3 結論

婺源皇菊總黃酮最佳提取工藝為液料比24∶1（mL/g）、超聲時間31min、超聲功率200W，總黃酮得率為3.641%，該方法穩定可靠且條件溫和，可用于提取皇菊中黃酮類物質。本研究揭示了婺源皇菊總黃酮具有與VC相近的良好的抗氧化活性，具有良好的發展前景。