高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中腎上腺素和多巴胺殘留

張杉，周瑞澤，張文超，裴帆，史海良

（北京市食品安全監控和風險評估中心，北京100094）

腎上腺素（A或E）由腎上腺釋放，其生物合成主要是在髓質嗜鉻細胞中先形成去甲腎上腺素，再進一步經苯乙胺-N-甲基轉移酶的作用，使去甲腎上腺素甲基化而形成。作為激素和神經傳送體，腎上腺素可直接興奮腎上腺素α和β受體，使心臟收縮力上升，可擴張心臟、肝以及筋骨附近的血管，同時收縮皮膚、黏膜的血管，臨床上主要用于過敏性休克[1]、急性哮喘[2-3]及心搏驟停[4-6]等。

多巴胺（dopamine，或 3-羥酪胺，3，4-二羥苯丙胺）是酪氨酸在代謝過程中經二羥苯丙氨酸所產生的中間產物，又名兒茶酚乙胺或羥酪胺。作為神經傳導物質，多巴胺可幫助細胞傳送脈沖調控中樞神經系統的多種生理功能。除了作為去甲腎上腺素的前體外，還是維持錐體外系神經功能的重要神經介質。多巴胺具有β受體激動作用，也有一定的α受體激動作用，臨床上主要用于心臟手術[7-8]、腎功能衰竭[9]、心肌梗死[10]等各種類型的休克。

腎上腺素和多巴胺同屬于β-受體激動劑（苯乙胺類藥物）中內源性兒茶酚胺類神經遞質[11-12]，與人們的健康與疾病密切聯系，在人體組織系統的生理活動中起著廣泛的調節作用。但這兩種藥物作為動物生長促進劑的不規范使用并通過食物鏈進入人體，會影響人體中樞神經系統和心腎等器官的血液循環，出現各系統缺血癥狀和功能損害等不良反應。2002年農業部頒布的第235號公告中規定了腎上腺素在所有食品動物中允許使用，但不需要制定殘留限量，未規定多巴胺的限量。2010年農業部頒布的第176號公告規定了鹽酸多巴胺禁止在飼料和動物飲用水中使用。2010年國家頒布的禁止在食品中添加的藥物品種名錄中明確規定在動物食品中腎上腺素受體激動劑類藥物均不得檢出，并未提及腎上腺素和多巴胺。目前國家尚未制定食品中相應的殘留限量標準，只在2008年奧運會的賽事食品監測中規定了腎上腺素的臨時限量值。關于腎上腺素和多巴胺的研究多見于大鼠組織、人體血尿中的報道，檢測方法主要有毛細管電泳法[13-15]、電化學分析方法[15]，熒光光譜法[15]，分光光度法[16]、酶聯免疫分析法[17]、液相色譜質譜聯用法[18-22]、液相色譜法[23-25]；現行國家標準GB/T 21036—2007《飼料中鹽酸多巴胺的測定高效液相色譜法》為飼料中鹽酸多巴胺的高效液相色譜檢測法，NY/T 3147—2017《飼料中腎上腺素和異丙腎上腺素的測定液相色譜-串聯質譜法》為飼料中腎上腺素的液相色譜-串聯質譜法，未見食品中腎上腺素和多巴胺的標準檢測方法。因此，亟需出臺相關政策和檢測方法合理規范和監控動物源性食品中腎上腺素和多巴胺的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、熱狗腸、雞蛋、牛奶、蛋糕：市售。磷酸二氫鉀、乙二酸四乙酸二鈉、三氯乙酸、氨水（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸銨、甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：德國Fisher公司；腎上腺素（純度99.7%）、鹽酸多巴胺（純度99.8%）：中國食品藥品檢定研究院；腎上腺素-D3（純度97.0%）：加拿大TRC公司；水為GB/T 6682規定的一級水；Waters Oasis WCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）：美國 Waters公司；0.22 μm有機尼龍濾膜：美國博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290超高效液相色譜串聯Agilent 6470三重四極桿質譜儀，配有電噴霧電離源（ESI）：美國Agilent公司；GL-88B型渦旋混合器：中國海門市其林貝爾公司；KQ-5200型超聲波清洗儀：中國昆山市超聲儀器有限公司；冷凍離心機：美國Thermo公司；正壓固相萃取儀：美國J2公司。

1.3 標準溶液配制

分別準確稱取10 mg各標準品（精確至0.000 1 g），置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，配成濃度為1 000 mg/L標準儲備液，-18℃保存。

分別吸取適量腎上腺素和多巴胺標準儲備液，用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/L的混合標準工作液。

吸取適量腎上腺素-D3標準儲備液，用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/L的內標標準工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 質譜條件

電離方式：電噴霧電離，ESI；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣：氮氣；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：5L/min；檢測方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力：45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度：350℃；鞘流氣流量：11 L/min。

1.4.2 液相條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）；流動相流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

1.4.3 試樣的提取與凈化

1.4.3.1 提取

稱取約2.00 g肉及肉制品試樣（精確至0.01 g），加入100.0 μL同位素內標工作液，加入2 mL水，渦旋混勻，加入4%磷酸鹽緩沖液8 mL，渦旋30 s，20℃超聲10 min，4℃條件下9 500 r/min離心5 min，移取上清液5 mL，用氨水調 pH6～7，待凈化。

稱取約2.00 g蛋、乳及蛋乳制品（精確至0.01 g），加入100.0 μL同位素內標工作液，渦旋混勻，加入4%磷酸鹽緩沖液8 mL，渦旋1 min，4℃條件下9 500 r/min離心5min，移取上清液5mL，用氨水調pH6～7，待凈化。

1.4.3.2 凈化

待凈化液過WCX固相萃取柱（依次用甲醇3 mL、水3 mL活化），20 mmol/L乙酸銨溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，50%乙腈溶液（含2%甲酸）2 mL洗脫，渦旋混勻洗脫液，0.22 μm有機尼龍濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確定

采用直接進樣方式分別將濃度為100 ng/mL的腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺注入離子源中，在正離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺的準分子離子峰分別為m/z 184.1、187.1和154.1。以該準分子離子峰為母離子，再對破碎電壓和碰撞能量等進行優化，使定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大時為最佳，得到腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺的最佳質譜參數，參數如表2。

表2 腎上腺素和多巴胺的質譜參數Table 2 MS parameters for epinephrine and dopamine

2.2 液相條件的優化

2.2.1 流動相的優化

比較甲醇和乙腈的洗脫效果，發現甲醇和乙腈對腎上腺素和多巴胺的洗脫能力相當，出峰時間相似，在被測試的C18色譜柱上甲醇對基質的分離效果不如乙腈好，選用乙腈和0.1%甲酸溶液梯度洗脫，分離效果較好。因此，確定流動相為A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈。

2.2.2 色譜柱的選擇

以乙腈和0.1%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，在ESI正模式下，比較了①Waters ACCQ-TAGTMULTRA C18（100mm×2.1mm，1.7μm）、②資生堂ADMN（100mm×2.1mm，5μm）、③Waters HILLC（100mm×2.1mm，1.7μm）和④Thermo Hypersil GOLD（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）4種色譜柱對腎上腺素和多巴胺的分離效果。目標化合物在不同色譜柱上的色譜圖見圖1。

如圖1所示，在ULTRA C18色譜柱上，腎上腺素和多巴胺的保留時間為0.6 min，保留較差，且響應值低于2×103；腎上腺素和多巴胺在ADMN色譜柱上保留時間為1.4 min和1.6 min，但多巴胺的峰形很差；HILLC色譜柱在2.5 min后出現多個色譜峰，標準系列工作液不成線性關系，無法確認兩種化合物的出峰時間；Hypersil GOLD色譜柱上目標化合物的出峰時間在2 min左右，保留時間偏差小于2.5%，且能有效地排除基質干擾。因此選擇Thermo Hypersil GOLD色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）進行后續方法優化及樣品分析。

圖1 目標化合物在不同色譜柱上的色譜圖Fig.1 Chromatogram of target compounds on different columns

2.3 提取溶劑的選擇

腎上腺素和多巴胺在動物組織和生物樣品中主要以硫酸軛合物或葡萄醛酸軛合物等形式存在，樣品要先進行水解，使待測物游離或從組織中釋放以進行后續的溶劑提取。有機溶劑和pH值直接影響提取效率[15]。

本試驗選取了豬肉作為基質，選取了80%乙腈溶液（含2%甲酸）、80%乙腈溶液（含5%甲酸）、4%磷酸鹽緩沖液（含有三氯乙酸）、0.1 mol/L鹽酸和0.4 mol/L高氯酸作為提取液，通過加入200 ng/mL的混合標準工作液考察提取效果，結果如圖2。

圖2 不同提取溶劑回收率對比Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries

由圖2可知，其中兩種含酸的乙腈溶液的回收率為40%～60%，而且重現性較差[相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）大于 20%]，由于高氯酸具有氧化性，兒茶酚類化合物容易被氧化，所以0.4 mol/L高氯酸的回收率只有40%，使用含有三氯乙酸的4%磷酸鹽緩沖液提取目標化合物時，回收率均超過了80%（RSD小于10%），所以采用4%磷酸鹽緩沖液提取目標化合物。

2.4 超聲條件的選擇

超聲時間和超聲溫度的優化結果見圖3、圖4。

圖3 超聲時間的優化Fig.3 Optimization of ultrasonic time

由于動物源性食品中含有脂肪、蛋白質等成分，會對待測物質產生較大的影響，因此，在選擇提取方式時，既要降低基質的干擾，又要提高提取效率。勻漿提取容易造成試樣的交叉污染，且操作繁瑣；振蕩提取需要的時間較長；超聲提取操作簡便，不易損失，不易造成交叉污染，但要控制好溫度和時間。選取了功率為1 200 W的超聲波清洗儀，首先，超聲溫度為20℃時，考察豬肉試樣在不同的超聲時間（10、20、30 min）對目標化合物的提取效率，結果顯示隨著超聲時間的延長，目標化合物的提取回收率明顯下降（圖3）；然后，超聲時間為10 min時，考察豬肉試樣在不同的超聲溫度（20、30、40℃）對目標化合物的提取效率，而隨著超聲溫度的升高，回收率也有下降的趨勢（圖4），最終采用20℃超聲10 min提取試樣中的目標化合物。

圖4 超聲溫度的優化Fig.4 Optimization of ultrasonic temperature

2.5 待凈化液pH值的選擇

待凈化液在不同pH值范圍的凈化效果見如圖5。

圖5 目標化合物在不同pH值范圍的色譜圖Fig.5 Chromatograms of target compounds in different pH ranges

從圖5中可看出，當待凈化液pH＞8時沒有色譜峰，而且樣液是渾濁的；當pH＜5時，有色譜峰，但響應值不高；而pH6～7時，目標化合物的色譜峰明顯，回收率均高于80%。所以采用氨水調節待凈化液的pH值范圍為6～7。同時也考察了1%氫氧化鈉和氨水兩種溶液來調節pH值，使用1%氫氧化鈉時，待測物有時可以檢出，有時無法檢出，極為不穩定，故選擇了氨水來調節pH值。

2.6 凈化手段的選擇

不同固相萃取柱[①HLB固相萃取柱（3mL，60mg）、②WCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）、③MCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）]的凈化能力見圖 6、圖 7。

圖6 不同固相萃取柱回收率的比較Fig.6 Comparison of recovery rates of different SPE columns

圖7 多巴胺在不同固相萃取柱時的色譜圖Fig.7 Chromatogram of dopamine on different SPE columns

圖6結果表明，腎上腺素在MCX固相萃取柱上的回收率只有40%，而在前兩種固相萃取柱上的回收率均大于80%。由圖7可知，多巴胺在WCX固相萃取柱的回收率更好，基質干擾更少，可達到更低的檢出限。因此，最后選定使用WCX固相萃取柱（3 mL，60mg）。

2.7 方法驗證

2.7.1 標準曲線、檢出限和定量限

吸取適量混合標準工作液以及同位素內標工作液，用50%乙腈溶液（含2%甲酸）配成濃度分別為10、20、50、100、200、500 ng/mL 的標準系列工作液，標準測定液中同位素內標溶液濃度為50 ng/mL。將標準系列工作液按濃度由低到高分別進樣5 μL，測定結果經線性回歸，得回歸方程（Y為峰面積；X為質量濃度，ng/mL），本方法在10 ng/mL～500 ng/mL范圍內腎上腺素和多巴胺的線性良好，相關系數大于0.999，結果見表3。

表3 腎上腺素和多巴胺標準曲線的回歸方程和線性關系Table 3 Regression equations,correlation coefficients,and linear ranges of epinephrine and dopamine

向空白基質中添加不同濃度的混合標準工作液，以3倍信噪比和10倍信噪比分別測定方法的檢出限和定量限。畜肉及其制品的檢出限為10 μg/kg，定量限為 25 μg/kg；蛋、乳及蛋奶制品的檢出限為 20 μg/kg，定量限為 50 μg/kg。

2.7.2 回收率與精密度

分別選取具有代表性的試樣進行回收率與精密度試驗。每組準確稱取樣品6份，每份2 g，共3組，分別定量加入混合標準物質，豬牛羊的添加水平1～3分別為 25、50、250 μg/kg，蛋和液體乳的添加水平 1～3 分別為 50、100、500 μg/kg，按確定的檢測方法進行檢測，不同濃度的加標回收率為81.7%～113.7%，平均相對標 準偏差為1.0%～10.4%（n=6），結果見表4。

表4 7種基質中腎上腺素和多巴胺加標回收率及相對標準偏差結果（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation of epinephrine and dopamine in 7 kinds of matrix（n=6）

3 結論

本方法采用了含有三氯乙酸的磷酸鹽緩沖液提取，WCX弱陽離子交換固相萃取柱凈化，使用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中的腎上腺素和多巴胺。所得試樣凈化效果好，可將待測物和干擾物很好的分隔開，重復性好，可檢測的基質種類多，定量準確。所以，此法可以同時對動物源性食品中腎上腺素和多巴胺進行有效且準確的定性定量分析。