肉及肉制品中6種致病菌的GeXP多重PCR檢測

楊夢婕，徐玲麗，馬學(xué)軍，武桂珍

（1.國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京102206；2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海200335）

近年來全球食源性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢[1-2]，患者死亡率較高[3]。食源性疾病指的是經(jīng)過攝食途徑進(jìn)入到人體中的致病因子所引發(fā)的疾病，致病因子種類繁多，包括細(xì)菌、真菌和病毒等，而食源性致病菌以來源多樣、能在食品中迅速繁殖為特點(diǎn)而成為首要的致病因子，嚴(yán)重威脅著食品安全與人類健康[4-5]。 有研究顯示，肉及肉制品加工過程中發(fā)生的交叉污染導(dǎo)致的食物中毒發(fā)病率達(dá)到18.6%，單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等為重點(diǎn)致病菌檢測對象[6]，我國肉制品中致病菌的檢測相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)除上述4種致病菌外，還包含志賀氏菌、副溶血性弧菌等[7]，這些肉及肉制品中常見的致病菌與多數(shù)食源性疾病的爆發(fā)有關(guān)。

我國國標(biāo)中食源性致病菌的檢測多沿用傳統(tǒng)方法,耗時較長,不適宜應(yīng)對和控制大規(guī)模食源性疾病的爆發(fā)及食物中毒應(yīng)急處置。免疫學(xué)檢測技術(shù)存在靈敏度偏低、檢測通量小等缺點(diǎn),市場上的商業(yè)化試劑盒成本高，不易普及推廣。因此,建立一種準(zhǔn)確、高效、靈敏的食源性病原菌檢測體系顯得頗為重要。本研究以大腸桿菌O157∶H7rfbE基因、金黃色葡萄球菌FemA基因、志賀氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌tlh基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌PfrA基因和沙門氏菌invA基因作為目標(biāo)基因，建立了基于多重基因表達(dá)（gene expression profiler,GeXP）遺傳分析系統(tǒng)的能同時檢測上述6種食源性致病菌的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。該系統(tǒng)采用占主導(dǎo)地位的熒光標(biāo)記通用引物和特異性嵌合引物相結(jié)合建立多重PCR反應(yīng)體系，利用毛細(xì)管電泳分離檢測目標(biāo)擴(kuò)增片段的長度及其熒光信號，根據(jù)片段大小區(qū)分不同的致病菌[8]，在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對多個樣本同時進(jìn)行多種致病菌檢測，為食源性致病菌的快速檢測提供了新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與肉類樣本

大腸桿菌 O157∶H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株（CI21530CC）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC13565）、志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC（B）51592]、副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC17082）、單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19115）、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC（B）50115）：上海SCIEX公司。

雞肉、牛肉、豬肉、羊肉：市售。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根公司；多重PCR擴(kuò)增試劑盒：凱杰公司；TSBYE培養(yǎng)基：上海廣銳生物科技有限公司；DNA marker（DSS400，DSS600）、分離緩沖液、上樣緩沖液、分離膠等：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)、移液器：Eppendorf公司；PCR儀：Thermo公司；GeXP遺傳分析系統(tǒng)：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株基因組DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Cat.#DP302）說明書進(jìn)行基因組DNA提取。取1mL菌液，12000r/min離心2 min，收集菌體加溶菌酶、蛋白酶K及RNase進(jìn)行菌體裂解，56℃加熱30 min，然后相關(guān)溶液進(jìn)行抽提、洗脫，最終得純化 DNA60 μL，每 20 μL 分裝（避免反復(fù)凍融）于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計及特異性驗(yàn)證

以大腸桿菌O157∶H7 rfbE基因、金黃色葡萄球菌FemA基因、志賀氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌tlh基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌PfrA基因和沙門氏菌invA基因作為目標(biāo)擴(kuò)增基因,所用引物序列參照SN/T 2641—2010《食品中常見致病菌檢測PCR-DHPL法》。在所有正反向引物的5’端分別加入一段非同源性特異序列構(gòu)成嵌合引物，該非同源性特異序列作為通用引物（Tag），Tag序列為 Tag-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’和 Tag-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’，其中正向通用引物Tag的5’端標(biāo)記熒光染料Cy5（Cy5-Tag-F）。所有引物由上海生工公司合成，其中Cy5-Tag-F引物采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化方式，其他特異性嵌合引物及反向通用引物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 方式純化。使用單重PCR法驗(yàn)證各引物特異性，確定各目的基因擴(kuò)增片段的實(shí)際大小。引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 1 Sequences of the primers and the size of the PCR products

續(xù)表1 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Continue table 1 Sequences of the primers and the size of the PCR products

1.3.3 GeXP多重PCR體系特異性及靈敏性驗(yàn)證

1.3.3.1 GeXP多重PCR體系的特異性驗(yàn)證

將6種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA混合均勻作為GeXP多重PCR體系的模板，并向該體系加入對應(yīng)的6對引物，并設(shè)立陰性對照（以非目標(biāo)菌的DNA為模板）和空白對照（以無菌水為模板），根據(jù)擴(kuò)增片段長度經(jīng)過多次引物濃度調(diào)整優(yōu)化，最終確定正反向混合引物中各嵌合引物的工作濃度為50 nmol/L～200 nmol/L，通用引物的工作濃度為10 μmol/L。多重PCR反應(yīng)體系為：2*MIX 12.5 μL，正反向嵌合引物混合物各2.5 μL， 正反向通用序列引物（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL,RNase-無菌水補(bǔ)足至25 μL。 參考Temperature Swich PCR[9]（TSP）原理反復(fù)優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為:95℃，15s；95 ℃，30s；55℃，30 s；72 ℃，30 s，10 個循環(huán)；95 ℃，30 s；65℃，30s；72℃，30s，10 個循環(huán)；95℃，30s；48℃，30s；72℃，30 s，20 個循環(huán)。PCR結(jié)束后取1 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行GeXP系統(tǒng)毛細(xì)管電泳，選用分析參數(shù)（Default GeXP Analysis Parameter DSS-600）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的片段分析。

1.3.3.2 GeXP多重PCR體系的靈敏性驗(yàn)證

將6種標(biāo)準(zhǔn)菌的菌懸液（106CFU/mL）分別以10倍梯度稀釋后，提取基因組DNA進(jìn)行GeXP多重PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該法的靈敏性。每個濃度均在非同日重復(fù)3次。同時構(gòu)建重組質(zhì)粒（人gapdh基因片段克隆至pTOPO-TA/Blunt Simple載體）作為該多重PCR體系的陽性內(nèi)參。

1.3.4 實(shí)際樣本檢測

53份肉類樣品均采購于正規(guī)超市和生禽市場，包括雞肉15份（雞肝、雞翅、雞頭）、牛肉10份、豬肉20份（豬肝、豬耳、豬臀尖）、羊肉8份。對各種肉類隨機(jī)取樣15 g加入到TSBYE培養(yǎng)液中，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，第2天按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書取1.5 mL培養(yǎng)物進(jìn)行DNA提取，然后按1.3.3.1中GeXP多重PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重引物特異性驗(yàn)證

單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)GeXP系統(tǒng)毛細(xì)管電泳分析，各靶基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符，且每種菌的特異性引物只針對該菌，與其它菌均無交叉反應(yīng)，說明引物的特異性好。

2.2 GeXP多重PCR體系特異性驗(yàn)證

分別以6種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為樣本，經(jīng)GeXP多重PCR擴(kuò)增后，每個反應(yīng)只出現(xiàn)對應(yīng)的特異峰，結(jié)果如圖1所示，無非特異性峰出現(xiàn)，說明該多重體系的特異性好。

圖1 多重PCR體系的特異性驗(yàn)證Fig.1 The specificity results of GeXP multiplex PCR system

2.3 GeXP多重PCR體系靈敏性驗(yàn)證

以 6 種標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度分別為 106、105、104、103、102CFU/mL的混合液作待檢樣品，進(jìn)行GeXP多重PCR方法的靈敏度分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 多重PCR體系對混合模板靈敏性分析Fig.2 The sensitivity analysis of GeXP multiplex PCR system detection of mixed templates

結(jié)果表明，在103CFU/mL水平可以同時特異的檢測出6種致病菌。每個濃度均在非同日重復(fù)3次，獲得的結(jié)果相同（CV＜10%）。

2.4 實(shí)際樣本檢測

53份肉類樣品同時由SN/T 2641—2010和本研究建立的GeXP多重PCR法進(jìn)行檢測，結(jié)果對比如表2所示。

表2 隨機(jī)樣品中致病菌不同檢測方法結(jié)果對比Table 2 The comparison results of different detection methods for pathogens in random samples

GeXP多重PCR法多檢測出的2份沙門氏菌陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果經(jīng)BLAST比對與沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性達(dá)99%；其他3種菌（金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌）GeXP多重PCR法檢測均為陰性，經(jīng)行標(biāo)法檢測結(jié)果也為陰性，兩者一致。

3 結(jié)論與討論

目前我國肉及肉制品中致病菌的檢測方法主要是采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，生化反應(yīng)鑒定等方法，耗時費(fèi)力，難以適應(yīng)現(xiàn)代食品生產(chǎn)的檢驗(yàn)需要，因此建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法有著非常重要的意義。近年來，由于多重PCR的高效性和經(jīng)濟(jì)簡便，使得其越來越多地應(yīng)用在食品致病菌檢測領(lǐng)域，如雙重PCR方法檢測奇異變形桿菌與沙門氏菌，靈敏度分別為103CFU/mL和104CFU/mL；三重PCR技術(shù)快速檢測禽肉制品中沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其靈敏度為102CFU/mL～103CFU/mL；多重PCR方法同時檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌等致病菌,其靈敏度為103CFU/mL～104CFU/mL[10-12]。本研究建立的GeXP多重PCR法靈敏度與這些文獻(xiàn)報道相似，但可同時檢測6種致病菌，是基于一種新的基因表達(dá)譜定量分析平臺[13]，該平臺將多重PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合,采用通用引物和特異性引物相結(jié)合的方法，經(jīng)多次優(yōu)化后保持兩者合適的比例以及各特異性引物的工作濃度比例，同時采用的三步法擴(kuò)增溫度（TSP法）及循環(huán)次數(shù)，使得整個體系擴(kuò)增過程中由通用引物占據(jù)主導(dǎo)作用，有效降低因多重PCR的擴(kuò)增偏愛性出現(xiàn)假陰性結(jié)果的概率[14]；同時通過毛細(xì)管電泳直接顯示產(chǎn)物片段長度，更直觀簡便判讀檢測結(jié)果。筆者已在前期工作中將該技術(shù)成功運(yùn)用于人乳頭瘤病毒[15]、食品中轉(zhuǎn)基因成分[16]及細(xì)菌氨基糖苷類耐藥基因[17]的檢測。

本研究建立了一種特異性高和靈敏性好的可以單管同時檢測肉及肉制品中6種常見致病菌的檢測方法，檢測限為103CFU/mL。但本方法也存在一些缺陷，毛細(xì)管電泳相對比較靈敏，故易出現(xiàn)交叉污染問題，因此要盡可能減少操作步驟及提高人員操作的穩(wěn)定性；另外難以區(qū)分死菌和活菌造成的假陽性，如何消除死菌對檢測結(jié)果的影響有待進(jìn)一步研究。總之，該方法具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價值，但仍需要大量實(shí)際樣本的驗(yàn)證和進(jìn)一步優(yōu)化體系，希望進(jìn)一步擴(kuò)大檢測通量，在食品安全監(jiān)管領(lǐng)域有較強(qiáng)的實(shí)用推廣應(yīng)用價值。