云木香中1個新愈創木烷型倍半萜內酯

胡祖艷，刀建華，趙 旻

1.西雙版納州食品藥品檢驗所，云南 景洪 666100

2.四川大學華西醫院，四川 成都 610041

云木香為菊科（Asteraceae）風毛菊屬SaussureaDC.植物云木香Saussrurea costus(Falc.) Lipsch.的干燥根，為多年生草本植物，又名青木香、廣木香、興瞿草[1]。始載于《神農本草經》，列為上品，木香藥用歷史悠久，干燥根入藥，有健脾消食、行氣止痛、止痛、安胎的功效[1-2]。現代藥理學研究證實，云木香對人體和動物的消化系統[3-6]、呼吸系統[7]、心血管系統[8-9]等方面疾病表現出很好的療效。云木香的化學成分多樣，目前主要集中在揮發油成分的研究，為了深入研究云木香的化學成分，本實驗對云木香干燥根的乙醇提取浸膏石油醚萃取部分進行分離純化，從中分離得到1個新的愈創木烷型倍半萜類衍生物，然后運用高分辨質譜、核磁共振等波譜技術，并結合弱堿水解的方法對其進行結構確證，最后鑒定為云木香素A（costusin A，1），它的2個水解產物為3-epizaluzanin C（1a）和正癸酸（1b）。結構見圖1。采用Griess法初步評價化合物1化合物對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7產生NO的抑制活性。結果表明，化合物1對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO顯示出中等的抑制作用，半數抑制濃度（IC50）為21.7 μmol/L。

圖1 化合物1的化學結構Fig.1 Structure of compound 1

1 儀器與材料

Perkin Elmer Model 341型旋光儀（美國PE公司）；Perkin Elmer one FT-IR型紅外光譜計（美國PE公司）；Shimadazu UV-2401紫外可見分光光度計（日本Shimadazu公司）；Bruker Ascend 400型核磁共振儀、Bruker MicrOTOF QII型高分辨率質譜儀（德國Bruker公司）；LC-3000型高效液相色譜儀（北京創新恒通公司）；Kromasil C18反相半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠（中國青島海洋化工廠）；50 μm ODS反相C18填料（日本YMC公司）；50 μm MCI樹脂（日本Mitsubishi Chemical公司）。氘代試劑（美國Sigma Aldrich公司）；色譜純甲醇（天津康科德科技有限公司）；其他分析純化學試劑（天津富宇精細化工有限公司）；Griess試劑法NO試劑盒（碧云天生物技術研究所）；脂多糖（美國Sigma Aldrich公司）；RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）。

云木香藥材為2019年10月購于成都市荷花池中藥市場，由成都中醫藥大學郭大樂副教授鑒定為菊科風毛菊屬植物云木香S.costus(Falc.) Lipsch.的干燥根，樣本（HX20191002）存放于四川大學華西醫院。

2 提取與分離

云木香干燥根4 kg，粉碎后用95%乙醇常溫浸泡提取3次，每次浸提3 d。合并提取液并減壓濃縮至浸膏，得總提取物860 g。將總浸膏分散于5 L熱水中（60 ℃），用等體積的石油醚萃取3次，減壓濃縮得到石油醚浸膏（116 g）。將該石油醚浸膏進行MCI柱色譜除色素，以甲醇-水（9∶1）進行洗脫，得到浸膏98 g。取該石油醚部位進行正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1）梯度洗脫，經薄層色譜檢識合并得到6個組分Fr.A～B（6.2 g）采用ODS中低壓柱色譜分離，甲醇∶水（1∶1→3∶2→7∶3→4∶1→9∶1）和甲醇梯度洗脫得到6個組分Fr.B1～B6。Fr.B4（615 mg）經半制備HPLC色譜（78%乙腈）等度分離，得到化合物1（13 mg，tR＝31 min）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末狀固體，[α]20D-45° (c0.2,CHCl3)。HR-ESI-MS顯示其準分子離子峰為m/z:423.250 9 [M＋Na]+（計算值為423.251 1，C25H36O4Na），由此推測其分子式為C25H36O4。紅外光譜顯示其結構中含有羰基（1 770.97, 1 732.96 cm-1）等基團。

1H-NMR譜（表1）顯示36個氫信號，包括6個烯氫信號δH6.26 (1H, d,J= 3.5 Hz), 5.48 (1H, s),5.45 (1H, d,J= 3.1 Hz), 5.33 (1H, s), 4.89 (1H, s) 和4.76 (1H, s)；5個次甲基的氫信號δH5.63 (1H, t,J=6.2 Hz), 3.85 (1H, t,J= 9.1 Hz), 3.01 (2H, m), 2.83(1H, m)；以及11組亞甲基的氫信號δH2.25 (2H, t,J= 7.5 Hz), 2.08 (1H, m)/2.47 (1H, m), 1.86 (1H,m)/2.24 (1H, m), 1.57 (2H, m), 1.34 (1H, m)/2.20 (1H,m) 和1.20～1.28 (12H, m)；另外，高場區有1個甲基氫信號 [δH0.81 (3H, t,J= 6.8 Hz)]。13C-NMR譜（表1）中有25個碳信號，結合HMQC譜分析分別歸屬為2個羰基碳信號δC173.4, 169.9；6個烯碳信號δC149.3, 148.1, 139.3, 120.4, 113.3, 115.2；5個次甲基碳信號δC85.0, 75.8, 49.8, 45.2, 44.6，其中存在2個連氧的次甲基碳信號δC85.0, 75.8；11個亞甲基碳信號δC37.3, 36.7, 34.5, 31.8, 31.0, 29.4, 29.3,29.2, 29.0, 24.9, 22.6；以及1個甲基碳信號δC14.0。經過文獻檢索，發現其中主要一維譜信號與愈創木烷型倍半萜3-epizaluzanin C[10]的信號非常相似，剩余信號又與正癸酸標準物質信號[11]相吻合。因此，初步判斷此化合物的結構特征為愈創木烷型倍半萜母核上連有長鏈飽和脂肪酸。

表1 化合物1的1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 數據Table 1 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) data for compound 1

然后，通過二維譜對其平面結構進行進一步的鑒定（圖2）。在HMBC譜中，H-1 (δH3.01) 與C-4(δC149.3), C-14 (δC113.3), C-6 (δC85.0), C-3 (δC75.8) 存在遠程相關；H-2 (δH1.86, 2.24) 與C-10 (δC148.1), C-5 (δC44.6) 有遠程相關；H-5 (δH3.01) 與C-10 (δC148.1), C-7 (δC45.2), C-2 (δC37.3) 存在遠程相關；H-6 (δH3.85) 與C-4 (δC149.3), C-1 (δC49.8), C-8 (δC31.0) 有遠程相關；另外，結合1H-1H COSY譜中H-3/H-2/H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9相鄰之間給出的相關信號；證明了其中五元環與七元環是通過1，5位碳進行駢合。H-7 (δH2.83) 與C-12 (δC169.9), C-13 (δC120.4), C-5 (δC44.6), C-9 (δC36.7)存在遠程相關；H-13 (δH5.45, 6.26) 與C-11 (δC139.3), C-12 (δC169.9), C-7 (δC36.7) 有遠程相關，可以推測出異丙烯酸連接在C-7位上并與C-6位羥基形成內酯。另外，連在C-4位的雙鍵位置可以根據H-15 (δH5.33, 5.48) 與C-4 (δC149.3) 和C-3 (δC75.8) 的遠程相關信號確定，而連在C-10位的雙鍵位置由H-14 (δH4.76, 4.89) 與C-10 (δC148.1), C-1(δC49.8), C-9 (δC36.7) 的遠程相關信號確定。最后，根據H-3 (δH5.63) 與C-1′ (δC173.4) 的遠程相關信號可以確定脂肪酸通過與C-3位羥基形成酯鍵相連。綜上，化合物1的平面結構鑒定為3-epizaluzanin C-3-yl decanoate（圖2）。另外，H-3與H-6的相對構型可以通過NOESY譜中H-3 (δH5.63) 與H-6 (δH3.85) 的相關信號得到判斷（圖3）。

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

圖3 化合物1的主要NOESY相關Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

為了對化合物1進行完整的結構確證，用0.1 mol/L KOH在常溫中對其進行溫和的堿水解，反應完成后加酸中和，用CH2Cl2萃取，萃取產物經HPLC制備得到水解產物1a和1b。通過與已知化合物3-epizaluzanin C[10]和正癸酸[11]進行波譜數據及理化性質的比對，確定化合物1a和1b分別為3-epizaluzanin C和正癸酸。綜上所述，化合物1的結構鑒定如圖1所示，經Scifinder檢索確定為新的愈創木烷型倍半萜衍生物，命名為云木香素A。

化合物1a：白色粉末狀固體，[α]20D-45° (c0.2,CHCl3)，HR-ESI-MS給出準分子離子峰m/z269.115 2[M＋Na]+（計算值為269.115 4），確定分子式為C15H18O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.18 (1H, d,J= 3.5 Hz, H-13β), 5.47 (1H, d,J= 3.1 Hz, H-13α),5.45 (1H, s, H-15β), 5.32 (1H, s, H-15α), 4.90 (1H, s,H-14β), 5.75 (1H, s, H-14α), 4.65 (1H, t,J= 6.2 Hz,H-3), 3.87 (1H, t,J= 9.2 Hz, H-6), 3.07 (2H, m, H-1,5), 2.83 (1H, m, H-7), 2.49 (1H, m, H-9β), 2.21 (1H,m, H-8β), 2.14 (1H, m, H-2β), 2.08 (1H, m, H-8α),1.84 (1H, m, H-2α), 1.36 (1H, m, H-9α)；13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 49.6 (C-1), 36.9 (C-2), 74.4(C-3), 154.1 (C-4), 45.6 (C-5), 85.2 (C-6), 44.1 (C-7),31.1 (C-8), 39.9 (C-9), 139.5 (C-10), 148.6 (C-11),170.2 (C-12), 120.5 (C-13), 113.2 (C-14), 112.9(C-15)。以上數據與文獻報道一致[10]，故鑒定化合物1a為3-epizaluzanin C。

化合物1b：白色結晶狀固體，HR-ESI-MS給出準分子離子峰m/z172.146 3 [M＋Na]+（計算值為172.146 3），確定分子式為C10H20O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.34 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-2), 1.63(2H, m, H-3), 1.35～1.27 (12H, m, H-4～9), 0.88 (3H,t,J= 6.8 Hz, H-10)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ:180.6 (C-1), 34.3 (C-2), 24.8 (C-3), 29.2 (C-4), 29.4(C-5), 29.5 (C-6), 29.4 (C-7), 32.0 (C-8), 22.8 (C-9),14.2 (C-10)。以上數據與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物1b為正癸酸。

4 NO抑制活性測定

參考文獻采用Griess法[12]評價化合物1對RAW 264.7細胞NO釋放的抑制作用。取處于對數生長期的RAW 264.7細胞，按1×105個/mL濃度進行稀釋，稀釋液加如96孔培養板中，每孔加入200 μL細胞懸液。隨后，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 h，每孔再加入LPS（1 μg/mL）及不同濃度（5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L）的測試樣品，然后在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后吸取培養液上清液100 μL轉移到酶標板中，在540 nm下測定吸光度（A），結果以IC50表示。結果顯示，化合物1對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO顯示出一定的抑制活性，IC50為21.7 μmol/L，而陽性藥吲哚美辛的IC50為15.4 μmol/L。

5 討論

本實驗采用各種色譜分離技術與波譜手段，并結合化學方法，從云木香中分離鑒定1個新愈創木烷型倍半萜，命名為云木香素A，該化合物對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO顯示出抑制作用，可為云木香的深入開發與利用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突