藥效學實驗結合正交設計優化消疹止痛凝膠提取工藝

郭 靜 ，玄振玉，岑 俊，謝 燕

1.上海中醫藥大學公共健康學院，上海 201203

2.蘇州玉森新藥開發有限公司，江蘇 蘇州 215125

3.上海建工醫院，上海 200083

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起的急性皰疹性皮膚病[1]，主要侵犯皮膚和局部神經，常伴有劇烈疼痛[2]。中醫認為，該病由外感濕熱毒邪火郁、氣血瘀滯所引發，故以清熱解毒、活血化瘀、通絡止痛為治療原則。諸多研究表明[3-5]，中醫藥在減輕皰疹癥狀及降低后遺神經痛發生率等方面頗具特色和優勢。消疹止痛凝膠（Xiaozhen Zhitong Gel，XZG）是來源于上海市中西醫結合醫院的臨床經驗方，由地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷、甘草6個藥味配伍而成。方中地龍清熱通絡為君；延胡索活血化瘀、行氣止痛，連翹、紫花地丁清熱解毒、涼血消腫為臣；白芷祛風除濕為佐；甘草調和諸藥為使。全方配伍共奏解毒利濕、消疹止痛的功效。臨床研究表明，該方能加快皰疹皮損區結痂，并有效緩解帶狀皰疹急性期疼痛[6]。

該復方制劑有多年臨床應用經驗，療效確切，現將其轉化為中藥新藥，提高患者用藥可及性。提取工藝研究是保證中藥新藥安全有效的關鍵環節[7]，工藝路線直接影響其藥效物質基礎。目前，在中藥復方新藥研究中，常用化學指標成分來確定其提取工藝路線，忽略與臨床療效的充分關聯[8-10]，故化學指標成分作為工藝評價指標有一定局限性。本實驗擬采用藥效學指標與化學指標相結合的方式，對XZG的提取工藝進行篩選、優化。選用單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型進行藥效學實驗，初步篩選出具有抗病毒和止痛作用的提取工藝路線；再通過正交試驗，以延胡索乙素轉移率和干膏得率為指標，考察該提取工藝的關鍵參數，從而確定XZG的提取工藝，為后期XZG的制劑工藝研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，含四元泵，柱溫箱，DAD檢測器，Chemstation B.04.03工作站，美國Agilent公司；CP225D分析天平，十萬分之一級，德國Sartorius公司；S210型pH計，梅特勒-托立多儀器（上海）有限公司；DHG 9140A鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試劑與材料

延胡索乙素對照品，批號110726-201718，質量分數99.9%，中國食品藥品檢定研究院；阿昔洛韋乳膏，福建太平洋制藥有限公司，批號180404；扶他林（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑），北京諾華制藥有限公司產品，批號X4775；乙腈為色譜純，美國Tedia有限公司；單純皰疹病毒液，購自中國醫學科學院醫藥生物技術研究所。

地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷和生甘草均購自亳州永剛飲片廠有限公司，產地分別為浙江、江蘇、河南、安徽、安徽和內蒙古，經上海中醫藥大學中藥研究所吳立宏研究員鑒定，地龍為鉅蚓科動物通俗環毛蚓Pheretima vulgarisChen的干燥體，延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.) Vahl的干燥果實，紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensisMakino的干燥全草，白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.的干燥根，生甘草為豆科植物光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖；甘油購自浙江遂昌惠康藥業有限公司；卡波姆購自上海運宏化工制劑輔料技術有限公司；經檢驗均符合《中國藥典》2015年版項下各項規定。

1.3 動物

ICR小鼠，SPF級，體質量（19±1）g，合格證號11400700104571，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證SCXK（京）2015-0001；豚鼠，普通級，體質量（300±20）g，合格證號11804800001841，北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司提供，動物許可證SCXK（京）2015-0005。所有動物實驗遵循小鼠和豚鼠有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 藥效學實驗篩選提取工藝路線

XZG原方采用乙醇浸漬提取后應用于臨床，藥材提取效率差。生產中乙醇滲漉法提取效率高且與原工藝提取原理一致；考慮藥材提取時加熱可增加分子間運動，提高溶解度和提取效率，故增設乙醇回流提取作對比；另傳統中藥復方常以水為溶媒煎煮提取，安全經濟；因此本實驗擬選取乙醇滲漉、乙醇回流和水煎煮3種提取工藝路線進行研究。

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起[11]，緩解急性期疼痛是XZG原方的臨床治療特色之一。針對以上2個主要藥效作用特點，本實驗選擇單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型進行初步藥效學實驗，比較3種提取工藝對皰疹癥狀的減輕程度和鎮痛作用的差異，以確定XZG的提取工藝路線。

2.1.1 樣品制備 按處方稱取粉碎后過10目篩的地龍、延胡索、連翹、紫花地丁、白芷和甘草各3份，按以下工藝進行提取。

（1）乙醇滲漉提取：加適量70%乙醇，以2 mL/min的體積流量滲漉提取，收集10倍藥材量的滲漉液，混勻。

（2）乙醇回流提取：加10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液。

（3）水煎煮提取：加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并提取液。

將上述提取液濾過，濾液于70℃減壓濃縮至相對密度為1.07，備用；另取卡波姆、甘油加入適量的純化水中，攪拌使溶脹；分別將上述濃縮液加入溶脹的卡波姆中，攪拌均勻，以適量三乙醇胺調pH值至6.5，即得3個含藥凝膠（每克凝膠相當于含生藥0.8 g）。取卡波姆、甘油，不加提取液，同法制得空白凝膠。

2.1.2 劑量設計 參考《中藥藥理研究方法學》中“體表面積比”法換算動物臨床等效劑量[12]，均勻涂抹動物皮膚，以完全覆蓋為準，測得豚鼠凝膠涂抹量為1.2 g/只（相當于生藥3.2 g/kg），小鼠凝膠涂抹量為0.3 g/只（相當于生藥12 g/kg）；阿昔洛韋軟膏豚鼠按1.2 g/只（相當于生藥4 g/kg）涂抹，扶他林軟膏小鼠按0.15 g/只（相當于7.5 g/kg）涂抹給藥。

2.1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件進行數據分析，結果以±s表示。如符合正態分布，進行單因素方差分析，否則進行K-W非參數檢驗；單因素方差分析時，如方差齊性，采用LSD檢驗，如方差不齊，采用Tamhane’s T2檢驗。

2.1.4 對單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響

（1）分組和給藥：取豚鼠48只，按刺傷皮膚部位的破損程度分層隨機均分為6組，分別為對照組、模型組、陽性（阿昔洛韋）組、3種提取工藝組，每組8只，雌雄各半。將豚鼠背部區皮膚脫毛（4 cm×4 cm）后，用梅花針深刺皮膚造成破損，模型組及各給藥組背部破損部位滴涂100 μL稀釋10倍的單純皰疹病毒液，對照組給予等量生理鹽水，連續感染2 d。第1天感染后4 h各給藥組涂擦相應藥物，對照組和模型組涂擦空白凝膠，每日1次，連續給藥7 d。

（2）觀察方法：于感染當天開始觀察各組豚鼠背部病變情況，連續觀察12 d；按評分標準表記錄分數[13]（表1），將皮膚病變過程中所有分數加在一起得到累積計分，同時記錄各組動物的痊愈時間。

表1 單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型病變評分標準Table 1 Scoring criteria of skin lesions in guinea pigs infected with herpes simplex virus

（3）實驗結果：見表2。與對照組相比，模型組豚鼠感染區皮膚紅腫明顯，并伴少量滲液，有不同程度的小皰疹出現或局部皮膚呈暗紅色，病變狀況明顯增加；且痊愈時間延長8 d，有顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，陽性組、乙醇滲漉組和乙醇回流組感染區病變明顯減輕：病變累積計分由（20.00±1.39）分分別減少至（14.25±1.56）分（P＜0.01）、（16.25±1.10）分（P＜0.01）、（18.44±1.52）分（P＜0.05）；痊愈時間由（11.75±0.46）d分別縮短至（9.25±0.71）d（P＜0.01）、（9.75±1.02）d（P＜0.01）、（10.88±1.15）d（P＜0.05），均具有顯著性差異；說明乙醇滲漉組和乙醇回流組對豚鼠皮膚皰疹病毒均有減輕作用，并可縮短痊愈時間，且乙醇滲漉組的作用效果更好。

表2 XZG不同提取物對單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響 (±s , n = 8)Table 2 Effects of different extracts from XZG on skin infection model of guinea pigs infected by herpes simplex virus (±s , n = 8)

表2 XZG不同提取物對單純皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型的影響 (±s , n = 8)Table 2 Effects of different extracts from XZG on skin infection model of guinea pigs infected by herpes simplex virus (±s , n = 8)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 皮膚病變累積計分 痊愈時間/d對照 1.38±0.35 3.75±0.71模型 20.00±1.39## 11.75±0.46##陽性 14.25±1.56** 9.25±0.71**乙醇滲漉 16.25±1.10** 9.75±1.02**乙醇回流 18.44±1.52* 10.88±1.15*水煎煮 20.25±1.73 11.50±0.53

水煎煮組的皮膚病變計分和痊愈時間與模型組相比無差異，提示水煎煮組對豚鼠皮膚皰疹病毒無減輕作用。

2.1.5 對熱板致小鼠疼痛模型的影響

（1）篩選合格小鼠：恒溫水浴箱預先加熱至55 ℃，取ICR小鼠雌雄各半，每次1只放在熱板上，記錄小鼠出現舔后足所需時間，即為該鼠的痛閾值，凡舔后足時間小于5 s或大于30 s或跳躍者棄之不用。

（2）分組和給藥：取合格小鼠50只雌雄各半，按基礎痛閾值分層隨機均分為5組，分別為模型組、陽性（扶他林）組、3種提取工藝組，每組10只。將小鼠背部區皮膚脫毛（2 cm×2 cm）后，各給藥組脫毛區涂抹給藥，模型組涂抹空白凝膠，每日1次，連續給藥7 d。

（3）評價方法：分別于給藥后0.5、1、2 h測定小鼠痛閾值，如60 s仍無反應，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計算，連續觀察7 d。

（4）實驗結果：見表3。給藥前各組小鼠痛閾值均在17 s左右，無顯著差異。給藥后0.5 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組和水煎煮組痛閾值分別較模型組延長約17、14、11、8 s，且均具有顯著性差異（P＜0.01）；說明給藥后0.5 h，陽性組、3種提取工藝組均可延長小鼠痛閾。給藥后1 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組痛閾值較0.5 h均有所延長，分別延長了4、3、2 s，而水煎煮組痛閾值則無增加；與模型組比較，陽性組和乙醇滲漉組痛閾值分別從（19.70±9.93）s延長至（38.20±14.94）s（P＜0.01）、（35.06±18.91）s（P＜0.05），具有顯著性差異，乙醇回流組和水煎煮組痛閾值雖然較模型組有所增加，但無統計學差異。給藥后2 h，陽性組、乙醇滲漉組、乙醇回流組和水煎煮組痛閾值較1 h沒有增加；但與模型組比較，乙醇滲漉組和乙醇回流組痛閾值分別從（19.48±15.18）s延長至（33.64±14.38）s、（30.52±7.67）s，具有顯著性差異（P＜0.05）。以上結果表明，乙醇滲漉組在給藥后0.5、1、2 h均能夠顯著延長小鼠的痛閾值，表現出明顯的止痛作用。

表3 XZG不同提取物對熱板致小鼠疼痛模型的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effects of different extracts from XZG on pain model of mice induced by hot plate (±s , n = 10)

表3 XZG不同提取物對熱板致小鼠疼痛模型的影響 (±s , n = 10)Table 3 Effects of different extracts from XZG on pain model of mice induced by hot plate (±s , n = 10)

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 痛閾值/s給藥前 給藥后0.5 h 給藥后1 h 給藥后2 h模型 17.02±2.34 17.71±15.04 19.70±9.93 19.48±15.18陽性 17.16±1.38 34.30±10.78** 38.20±14.94** 32.89±21.56乙醇滲漉 16.89±2.04 32.69±17.85** 35.06±18.91* 33.64±14.38*乙醇回流 17.25±2.16 28.68±19.82** 30.49±14.54 30.52±7.67*水煎煮 17.08±2.23 26.19±7.64** 25.49±22.12 23.73±16.90

綜合皰疹病毒致豚鼠皮膚感染模型和熱板致小鼠疼痛模型2個藥效學實驗結果，發現3種提取工藝中乙醇滲漉組的抗皰疹病毒和止痛作用效果最好。與原方臨床應用時提取方式一致，另乙醇滲漉提取還可避免方中連翹苷、歐前胡素等化學成分受熱破壞而造成損失[14-15]。因此，確定采用乙醇滲漉法作為XZG的提取工藝。

2.2 正交試驗法確定滲漉提取工藝參數

乙醇滲漉提取法主要通過不斷加入新鮮溶劑造成濃度差，形成動態浸出，使有效成分提取完全，特別適用于遇熱不穩定的成分提取，但該方法乙醇消耗量較大，耗時較長[16-17]。為獲得穩定的提取工藝，并兼顧提取效率，取得成本最大效益比，本實驗綜合提取過程中的各個環節和因素，采用正交試驗法進行優化設計，確定XZG乙醇滲漉法的提取工藝參數。

2.2.1 延胡索乙素含量的測定[18]

（1）色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-1.2%三乙胺溶液（45∶55）為流動相；檢測波長為282 nm。理論板數按延胡索乙素峰計算不低于5000。

（2）對照品溶液的制備：取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含延胡索乙素25 μg/mL的溶液，即得。

（3）供試品溶液的制備：稱取處方量的藥材，加適量70%乙醇，以2 mL/min的體積流量滲漉提取，收集8倍藥材量的滲漉液，混勻，濾過，取續濾液，即得。

（4）陰性樣品溶液的制備：取缺延胡索的其他藥味按照供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液，即得。

（5）專屬性與系統適用性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，色譜圖見圖1。結果表明，供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間出峰，陰性樣品溶液對延胡索乙素的測定無干擾；以二極管陣列檢測器進行純度分析，主峰的純度因子為998.7。對照品5次峰面積的RSD為1.4%，理論塔板數按延胡索乙素峰計算為13 556，分離度3.1，符合系統適用性要求。

圖1 延胡索乙素對照品 (A)、XZG供試品 (B)、陰性樣品(C) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of tetrahydropalmatine reference substance(A), XZG sample (B), and negative sample (C)

（6）線性關系考察：分別精密量取延胡索乙素對照品溶液（質量濃度為251.2 μg/mL）1、2、5、10、25 mL分置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。以延胡索乙素對照品質量濃度為橫坐標（x），峰面積積分值為縱坐標（y）繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程為y＝8.673 5x－18.664，r＝0.999 9，結果表明延胡索乙素在5.0～125.6 μg/mL線性關系良好。

（7）穩定性試驗：取供試品溶液，在0、4、8、12、18、24 h分別進樣1次，記錄峰面積，結果延胡索乙素峰面積的RSD為1.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

（8）重復性試驗：制備6份供試品溶液，分別進樣10 μL并計算質量濃度。結果延胡索乙素的平均質量濃度為0.032 mg/mL，RSD為1.7%，表明方法重復性良好。

（9）加樣回收率試驗：取藥材9份，每份40 g，分別精密延胡索乙素對照品溶液（質量濃度為16.42 μg/mL）80、160、240 mL，平行3份，按供試品溶液制備方法制得滲漉液，搖勻，測定，計算回收率。結果延胡索乙素的平均回收率為96.6%，RSD為0.7%，表明方法準確度高。

2.2.2 干膏得率的測定 量取提取液25 mL，置干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至恒定質量，取出，置干燥器中，放冷，迅速稱定質量，計算干膏得率。

2.2.3 指標綜合評分法 方中延胡索具有活血化瘀、行氣止痛功效，延胡索乙素作為主要有效成分，藥理學研究顯示其具有明顯鎮痛作用[19]，選擇以延胡索乙素轉移率（Y1）為提取工藝研究的主要跟蹤指標，權重系數設為0.6；另外，干膏得率關系到制劑工藝、劑型的選擇及輔料的用量，以干膏得率（Y2）作為次要指標，權重系數為0.4，采用綜合評分（Y）法對提取工藝進行考察。

延胡索乙素轉移率＝提取液中延胡索乙素質量/(延胡索藥材中延胡索乙素含量×所用延胡索藥材質量)

干膏得率＝提取液總體積×干膏質量/(取樣體積×藥材總質量)

Yi＝(X1i/X1max×0.6＋X2i/X2max×0.4)×100

Yi表示第i個正交試驗的綜合評分值，X1i表示第i個正交試驗結果的延胡索乙素轉移率，X1max表示正交試驗結果中延胡索乙素轉移率的最大值，X2i表示第i個正交試驗結果的干膏得率，X2max表示正交試驗結果中干膏得率的最大值

2.2.4 正交試驗方法 參考相關文獻報道[16-17]，影響滲漉工藝的主要因素為提取溶劑的濃度與用量、滲漉速度等，本實驗在此基礎上，結合預實驗結果，選取乙醇體積分數（A）、滲漉體積流量（B）、乙醇用量（C，以收集滲漉液的體積計）為考察因素，每個因素選取3個水平，因素與水平表見表4。稱取處方量藥材共9份，照L9(34)表進行正交試驗，加入不同體積分數乙醇，控制滲漉體積流量進行提取，收集相應體積的滲漉液，濾過，即得。以提取液中延胡索乙素轉移率和干膏得率為評價指標，采用綜合評分法進行正交試驗分析。

2.2.5 正交試驗結果分析 正交試驗結果及方差分析見表4、5。正交試驗的直觀分析（表4）顯示，乙醇體積分數、滲漉體積流量、乙醇用量3個因素的極差R值分別為88.9、4.9、8.3，表明3個因素對試驗指標影響的主次順序依次是A（乙醇體積分數）＞C（乙醇用量）＞B（滲漉體積流量）；K值表示各因素下3個水平分別對試驗指標的影響大小，K值最大則作為該因素的最優水平，根據表4中K1、K2、K3大小分析得出，不同水平對試驗指標的影響程度依次是A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1，即各因素最優水平分別為A1、B2、C3。

表4 滲漉提取工藝正交試驗設計與結果Table 4 Orthogonal experiment design and results of percolation extraction technology

方差分析（表5）結果顯示，因素A的F值為461.556 6，大于F0.01(2,2)＝99.00，說明A（乙醇體積分數）對試驗指標有顯著性影響（P＜0.01），結合直觀分析顯示的A1水平最優，因此A因素選取A1水平，即滲漉提取的乙醇體積分數為60%。而B（滲漉體積流量）的F值為1.392 0、C（乙醇用量）F值為4.605 0，均小于F0.05(2,2)＝19.00，表明B和C因素對試驗指標無顯著性影響（P＞0.05）。

表5 滲漉提取工藝方差分析結果Table 5 Variance analysis of percolation extraction technology

正交試驗結果中綜合評分顯示，提取工藝為A1B2C2的評分最高，A因素為A1水平，與方差分析結果一致；B和C因素為B2、C2，均取各水平的中間值，從滲漉效率和節約溶劑角度考慮也較為合理。綜上，通過正交試驗初步選擇提取工藝條件為A1B2C2，即60%乙醇滲漉提取，滲漉體積流量為4 mL/min，收集滲漉液體積為8倍藥材量。

2.2.6 提取工藝驗證試驗 稱取2倍處方量藥材，平行3份，加入適量60%乙醇，以4 mL/min的體積流量進行滲漉提取，收集8倍藥材量的滲漉液，計算延胡索乙素轉移率和干膏得率，結果見表6。結果顯示，延胡索乙素平均轉移率為81.2%，RSD為0.5%；干膏平均得率為14.2%，RSD為0.7%；平均綜合評分值為97.8；結果表明，3次試驗結果和正交試驗綜合評分最大值相當，且組間均無顯著性差異，表明該提取工藝參數A1B2C2合理可行，穩定性較好。

表6 滲漉提取工藝方差分析結果Table 6 Comprehensive score results of percolation extraction technology

3 討論

進行滲漉提取時，藥材粒度大小是重要的影響因素。粒度過大，滲漉時顆粒間隙大，導致溶劑消耗量大，且提取不完全；但顆粒過細會造成滲漉壓降過大，滲漉系統能耗過高，造成提取效率較低[20]。本實驗在正交試驗前，先以延胡索乙素轉移率和干膏得率為指標對藥材的粉碎粒度進行了考察。結果顯示，藥材粉碎后分別過10、16、24目篩，延胡索乙素轉移率和干膏得率無顯著差異，但過10目篩的藥材滲漉效率高，不易發生堵塞，因此選擇將藥材粉碎過10目篩進行滲漉提取。

XZG處方中不含貴重藥和毒性藥味，通常盡可能選擇君藥、臣藥中的藥效成分作為跟蹤指標。方中地龍為君藥，其主要成分為蛋白質、氨基酸和脂類[21]，特征性專屬成分不明確，目前對含地龍中藥制劑的質量控制研究較少，因此，未將地龍中的成分作為工藝跟蹤指標。連翹和延胡索為方中臣藥，前期研究中發現，連翹中主要藥效成分連翹苷的陰性干擾較大，供試品制備方法復雜，不適宜作為指標成分跟蹤工藝過程；而延胡索中的延胡索乙素為其特征性成分并具有明顯的鎮痛作用，能夠體現工藝特點，因此本實驗選用延胡索乙素作為正交試驗的指標成分，優化提取工藝。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突