科研與教學相結(jié)合的《細胞生物學實驗》教學模式探究
——以熒光標記的細胞融合實驗為例 *

成希飛 方廖瓊

(1. 西南大學教務(wù)處，重慶 400715; 2. 西南大學蠶桑紡織與生物質(zhì)科學學院，重慶 400715)

隨著中國高等教育迅速發(fā)展，教育教學改革不斷深化，培養(yǎng)本科生的科研能力已成為強化素質(zhì)教育和深化高等教育改革的一項重要內(nèi)容[1]。教育部《關(guān)于一流本科課程建設(shè)的實施意見》中指出：一流本科課程教學內(nèi)容要體現(xiàn)前沿性與時代性，及時將學術(shù)研究、科技發(fā)展前沿成果引入課程。細胞生物學作為生物科學中發(fā)展最快的一門尖端學科，是生物、農(nóng)學、醫(yī)學等相關(guān)專業(yè)學生的學科必修課程，該門課程又包括理論與實驗兩部分，其中《細胞生物學實驗》課程要求學生具有較好的實際操作與嚴謹思維能力[2]。越來越多的生物、農(nóng)學、醫(yī)學專業(yè)的學生在完成本科學習之后進入研究生階段深造學習，在研究生學習階段細胞生物學相關(guān)的實驗技能又是必需掌握的基礎(chǔ)實驗技能之一。這就需要在本科階段的《細胞生物學實驗》課程教育中更加注重學生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，加強學生科研思維能力及實驗技能的訓練。

傳統(tǒng)的細胞生物學實驗往往由于課時的限制，偏重于基礎(chǔ)性、驗證性實驗。為了提升本科生對《細胞生物學實驗》課程的學習成效，部分高校進行了實驗教學改革，取得了良好的效果[3-6]，在很大程度上改善了原來教學內(nèi)容老舊、無連貫性以及以操作簡單的驗證實驗為主等問題。本校生物技術(shù)專業(yè)的《細胞生物學實驗》課程同樣受到了越來越多的關(guān)注和重視，課程學時逐漸增多。從2014級開始，《細胞生物學實驗》課程學時由之前的18個學時增加至27個學時，內(nèi)容包括細胞大小的測定及計數(shù)、熒光顯微鏡及相差顯微鏡的使用、細胞器的分離及觀察、細胞化學、細胞膜通透性的觀察、細胞骨架的觀察、細胞傳代培養(yǎng)及周期觀察、細胞融合共8項實驗。在最新制定的2018級實驗教學大綱中，《細胞生物學實驗》課程學時由27個學時增加至40個學時，對課程內(nèi)容也做出了相應(yīng)的調(diào)整，增加了開放性、綜合性實驗；在原有實驗內(nèi)容的基礎(chǔ)上增加了細胞凍存及復蘇、MTT法測定細胞活力實驗，并且對細胞融合實驗方法做了改進，改為熒光標記的細胞融合觀察。新的《細胞生物學實驗》教學大綱中還增加了細胞傳代培養(yǎng)及周期觀察實驗的學時數(shù)，要求學生能夠熟練掌握細胞培養(yǎng)技術(shù)，并且在細胞培養(yǎng)過程中完成MTT法測定細胞活力及熒光標記的細胞融合實驗，將相關(guān)實驗融合成為一個互相關(guān)聯(lián)的設(shè)計性、開放性實驗，目的是增強學生的學習興趣及動手能力，同時也增強學生的實驗設(shè)計及查閱相關(guān)科技文獻的能力。

本文以熒光標記的細胞融合實驗為例，闡述對實驗課程的設(shè)計與方法進行改進的重要性。現(xiàn)有《細胞生物學實驗》教材中細胞融合實驗多以雞血紅細胞為實驗材料[7]，采用不同技術(shù)手段(主要包括PEG法、電擊法等)[8]誘導細胞融合，通過普通生物顯微鏡觀察細胞形態(tài)判斷細胞是否發(fā)生融合。以熒光標記的細胞融合實驗將小鼠淋巴瘤細胞(Yac-1)作為實驗材料，在原有細胞融合實驗技術(shù)基礎(chǔ)上進行的改進如下：通過采用DiO和DiI兩種熒光探針分別標記細胞，DiO標記的細胞膜只在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，DiI標記的細胞膜只在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光；采用PEG4000溶液誘導Yac-1細胞進行融合，并用DAPI熒光染料標記細胞核。采用熒光顯微鏡進行觀察，融合了的細胞膜會發(fā)出被DiO和DiI標記產(chǎn)生2種顏色的熒光，細胞核通過DAPI染色后會發(fā)出藍紫色熒光。以熒光標記的細胞融合實驗方法新穎，不僅更加利于對細胞是否發(fā)生融合進行觀察，而且有利于啟發(fā)學生的科研思維和增強其實驗操作能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料為小鼠淋巴瘤細胞Yac-1細胞株，由西南大學生命科學實驗教學中心保存。

1.2 主要試劑和儀器

PEG4000(重慶川東化工有限公司)，1640培養(yǎng)基(上海ExCell公司)，胎牛血清、雙抗、Hanks液(帶離子)、DiO、DiI、DAPI均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

水浴鍋(上海柏欣儀器設(shè)備廠)，3111二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，BK-FL熒光顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞標記

參照文獻[9]的方法。選擇生長狀態(tài)良好的Yac-1細胞，取0.5 mL細胞懸液(106個/mL左右)于2根離心管中，使用低速離心機1 000×g離心10 min，棄去上清液。加入0.5 mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清及1%雙抗)，充分吹打重懸細胞，1 000×g離心10 min，棄去上清液，重復1次，充分洗凈細胞。分別在2根離心管中加入40 μL DiO或DiI(60 μmol/L，使用DMSO配制)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中保溫30 min。

1.3.2 細胞融合

用Hanks液配制質(zhì)量分數(shù)為40%～50%的PEG溶液1 mL，放入37 ℃水浴鍋中備用。將標記好的細胞懸液1 000×g離心5 min，棄去上清，2管中分別加入5 mL Hanks液，用吸管將細胞吹散，混勻2管細胞，然后1 000×g離心5 min，棄去上清，剩余液體1 mL左右，用吸管緩慢地將細胞團塊吹散。取預熱的PEG溶液1 mL，在1 min內(nèi)滴加到細胞懸液中，注意控制時間，滴加速度不可過快或過慢，邊滴加邊輕輕搖動混勻。待PEG全部加入后靜置3 min。緩慢滴加10 mL Hanks液以終止PEG的作用，在37 ℃水浴內(nèi)靜置5 min。離心棄上清，剩余2 mL左右液體，混勻后制備裝片，再加入5 μL DAPI染料，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

在細胞融合之前，用DiO標記的Yac-1細胞的細胞膜在藍光下會發(fā)出綠色熒光，DiI標記的細胞膜會在綠光下發(fā)出紅色熒光。細胞融合成功之后，融合的細胞會同時發(fā)出綠色熒光和紅色熒光，經(jīng)DAPI標記后，細胞核會發(fā)出藍紫色熒光(圖1)。由圖1-A和B可以明顯地看出，只有細胞膜既能發(fā)出綠色熒光，又能發(fā)出紅色熒光的細胞為融合細胞。如圖1-A、C左下方的3個細胞，細胞核具有藍紫色熒光而細胞膜只能發(fā)出綠色熒光，而在圖1-B中未顯示，說明此3個細胞為未融合細胞。

圖1 熒光顯微鏡下觀察到小鼠淋巴瘤細胞(Yac-1)間的融合

3 討 論

3.1 對實驗方法進行改進的益處

傳統(tǒng)細胞融合的觀察方法有較大的局限性：采用普通生物顯微鏡對細胞進行觀察，緊挨著的2個細胞無法判斷到底是發(fā)生融合還是由于細胞分散不好形成的細胞團塊，這就會造成融合率計算不準確，并且細胞核是否融合也不容易被觀察到。改進后實驗方法較原來相比有了明顯進步，用熒光顯微鏡可觀察到融合的細胞會在藍光與綠光下同時發(fā)出綠色和紅色熒光，而且通過對細胞核的熒光標記對比融合的細胞核體積會有所增大，因此用改進的實驗方法可以幫助學生更加清晰、準確地觀察細胞融合的過程。此外，用改進的實驗方法在實驗前還要求學生查閱科研文獻，了解細胞融合所需PEG溶液的濃度以及滴加PEG溶液的時間等實驗條件，并且要求學生在一定范圍內(nèi)按照參考文獻的結(jié)果來優(yōu)化設(shè)置擬開展實驗的條件。這樣的施教方式既鍛煉了學生查閱科研文獻的能力，又增強了學生學習的主動性，改變了學生以往只是按照老師設(shè)置的實驗條件進行驗證實驗操作的被動學習方法，真正達到了實驗課程的教學目的。

3.2 實驗教學過程中的注意事項

細胞的狀態(tài)對細胞融合的影響很大，所以熒光標記細胞融合實驗使用的細胞要處于生長旺盛期，且生長狀態(tài)較好。本實驗課程設(shè)計為各小組獨立培養(yǎng)Yac-1細胞，然后采用各自小組培養(yǎng)的細胞進行融合實驗。實驗結(jié)束后的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)細胞狀態(tài)不好的小組，其后續(xù)的實驗很容易失敗，在熒光顯微鏡下無法找到熒光標記的細胞。因此，要求學生在實驗中嚴格規(guī)范細胞培養(yǎng)的各項操作，例如PEG溶液滴加時需不斷搖晃離心管，以免造成細胞懸液局部PEG濃度過高而損傷細胞。

4 結(jié) 語

細胞融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[10]、腫瘤研究[11]、克隆抗體[12]、作物育種[13]、環(huán)境微生物學[14]等領(lǐng)域。本次熒光標記細胞融合實驗課程的設(shè)計，將傳統(tǒng)的驗證性實驗方法轉(zhuǎn)化成綜合性實驗，并融合多種技術(shù)手段，使學生通過清晰、準確的觀察對細胞結(jié)構(gòu)有更深一步的了解，有利于激發(fā)他們對細胞生物學實驗的濃厚興趣。

隨著科學技術(shù)發(fā)展的日新月異以及細胞生物學在生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越普遍，對本科階段的《細胞生物學實驗》教學進行改革勢在必行[15]。今后將進一步通過對教學方法、教學內(nèi)容、評分標準等進行改革，將經(jīng)典實驗方法與現(xiàn)代實驗技術(shù)相結(jié)合，以期更好地培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力[16]。