柱前紫外衍生—高效液相色譜法測定川貝母生物堿貝母素甲的含量

徐順連，周加本，馬維博，陳 志

(1.青海師范大學，青海 西寧 810008；2.河北工業大學，河北 石家莊 300401)

川貝母，主要是指川貝母(Fritillariaecirrhosae(CB-Fc)，暗紫貝母(Fritillariaeunibracteata(CB-Fun))和貝母(Fritillariaeprzewalskii(CB-Fp))植物的干燥球莖，是四川省地理特色的原料藥材之一[1]。其干燥鱗莖具有化痰止咳、清熱潤肺、散結消癰的功能，主治干咳少痰、咯痰帶血、陰虛勞咳等癥，廣泛用于中藥方劑及中成藥中[2]。生于海拔3 000～4 000 m山坡草叢或陰濕的小灌木叢中[3]。生物堿是川貝母的特征性成分[4]，其甾體生物堿是川貝母的主要活性成分[5]。由于川貝母中的大部分生物堿都不含生色團，當用紫外檢測器進行檢測時，紫外吸收很弱，所以王麗芝等人通常采用HPLC-ELSD的方法，同時檢測川貝母藥材中4種生物堿(貝母辛、西貝素、貝母素甲和貝母素乙)[6]。但是采用以上方法檢測貝母屬植物中其他生物堿時，會出現貝母素甲和貝母素乙含量都較低，未檢測到西貝母堿等情況[7～9]。因此，本文主要采用柱前紫外衍生的方法對川貝母中的生物堿貝母素甲進行檢測，這為川貝母中其他生物堿的檢測方法提供了借鑒和參考。

1 儀器試藥

島津高效液相色譜儀(LC-20AT) 色譜柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)，SPD-M20A 二極管陣列檢測器 KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，沃特浦超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)，電子恒溫水浴鍋(上海赫田科學儀器有限公司)。貝母素甲對照品(純度99% ，北京諾禾致源科技股份有限公司)，對甲苯磺酰氯(純度98%阿拉丁科技有限公司 批號：A2010137)，甲酸(純度為99.0%，天津市福晨化學試劑廠)，水為去離子水，甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：甲醇—水(60∶40，V∶V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 貝母素甲標準溶液的制備 精密稱取20 mg貝母素甲標準品于100 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取500 mg樣品，加入1 ml氨水浸潤1 h，隨后加入10 ml三氯甲烷：甲醇=4∶1，加熱回流處理2 h；取出5 ml濃縮熱干，加入500 μL甲醇復溶，待用。

2.2.3 衍生試劑的制備 精密稱取400 mg的對甲苯磺酰氯于100 ml的容量瓶中，充分振蕩搖勻，用乙腈定容至刻度線。

2.2.4 衍生反應的過程 取川貝母提取液1 ml于25 ml的圓底燒瓶中，加入2 ml的衍生試劑，然后在70℃的水浴鍋上加熱回流1 h時冷卻至室溫，取1.5 ml于安培瓶中，按2.1 的色譜條件測定產物的峰面積。

3 色譜條件

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇 使用DAD紫外檢測器對衍生劑和衍生產物分別進行掃描，在200～400 nm的范圍內，衍生產物在240 nm處有最大吸收峰，而對甲苯磺酰氯在該處無吸收，故選擇240 nm作為檢測波長。

3.1.2 流動相的選擇 以甲醇—水作為流動相，考察不同體積比的甲醇—水對衍生產物分離的影響。結果表明：隨著甲醇含量的增加，保留時間縮短，當甲醇含量在60%時，峰形良好。綜合考慮，選定甲醇—水(60∶40，v/v)(2/1 000的甲酸)作為流動相。

3.1.3 流速的選擇 實驗考察了不同流速(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml/min)對衍生產物分離的影響。隨著流速的增加，保留時間縮短，峰形較好。 綜合考慮分析時間、分離效率等因素，確定流速為1.00 ml/min。

3.1.4 柱溫的選擇 在其他色譜條件不變的情況下，實驗考查了不同柱溫(30℃～40℃)對衍生產物分離的影響。結果表明：隨著溫度的升高，貝母素甲的衍生物色譜峰的保留時間縮短，峰面積增加，但出現峰展寬。綜合考慮分析時間、分離效率等因素，確定柱溫為35℃。

3.2 衍生反應條件的確定

3.2.1 衍生時間 當衍生反應的溫度為70℃時，分別試驗時間為40、45、50、55、60、65 min對衍生產物峰面積的影響，結果發現在60 min后，衍生反應完全，故確定衍生時間為60 min，結果見圖1。

圖1 貝母素甲衍生產物峰面積與反應時間的關系

3.2.2 衍生溫度 取貝母素甲標準溶液1 ml于圓底燒瓶中，再加入2 ml的衍生試劑，平行操作6次，分別于50、55、60、65、70、75℃的水浴鍋中反應，分別反應60 min后冷卻至室溫，按2.1的色譜條件測定反應產物的峰面積，結果見圖2，反應產物的峰面積在70℃時達到最大。

圖2 貝母素甲衍生產物峰面積與反應溫度的關系

3.2.3 衍生劑的用量 當衍生反應溫度為70℃、衍生反應時間為60 min時，分別試驗衍生劑的用量為反應物的1.4、1.6、1.8、2.0、2.2倍時，對衍生產物峰面積的影響，結果表明，峰面積在2倍時達到了最大值，結果見圖3。

圖3 貝母素甲衍生產物的峰面積與衍生劑用量的關系

3.3 方法性能指標

3.3.1 專屬性試驗 取1 ml的樣品溶液于圓底燒瓶中，再加入2 ml的衍生試劑，然后按照2.2.4的操作步驟進行衍生后，用2.1的色譜條件進行測定，結果圖4、5，衍生試劑對衍生產物無干擾，專屬性良好。

圖4 川貝母生物堿貝母素甲衍生后的HPLC

圖5 衍生試劑的HPLC

3.3.2 線性關系考察 線性范圍和檢出限以保留時間定性，峰面積定量，貝母素甲在0.05～2.50 μg/ml范圍內線性關系良好，經線性回歸，得回歸方程為y=2E+06x+3E+06，相關系數為R2=0.9993。

3.3.3 精密度試驗 將川貝母提取液按照2.2.4的衍生條件進行衍生，按照2.1的色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，RSD=2.4%。

3.3.4 重復性試驗 按照2.2.2的操作步驟制備6份提取液，按照2.2.4的衍生條件進行衍生，按照2.1的色譜條件分別進樣，記錄峰面積，RSD=2.7%。

3.3.5 穩定性試驗 將川貝母中的貝母素甲衍生后，分別于0、2、4、8、16、24 h進行測定，記錄峰面積，RSD=2.4%，表明樣品在24 h內穩定。

3.3.6 加樣回收率試驗 在實際樣品中加入不同濃度的貝母素甲標準溶液，按2.2.4進行衍生，按2.1的色譜條件進行進行測定，加標回收率結果見如下表，由表可見，加標回收率的范圍在95.67%～100%。

貝母素甲的加樣回收率試驗

3.4 樣品含量測定

取川貝母生物堿樣品，按上述制備方法和衍生條件反應后，測定川貝母中貝母素甲衍生產物峰面積，根據回歸方程計算貝母素甲的含量，結果表明，樣品中貝母素甲的含量為3.14%。