piR-10555對(duì)心肌細(xì)胞壞死的調(diào)控作用及其機(jī)制

王凱 王飛 陳鑫哲 周露玙

(青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，山東 青島 266021)

心血管系統(tǒng)疾病具有高發(fā)病率及高死亡率的特點(diǎn)[1]，而且患者發(fā)病愈來愈年輕化，對(duì)人類的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[2]。急性心肌梗死是心血管疾病中較為嚴(yán)重的一種，早期診斷和及時(shí)治療是臨床的迫切需要。心肌梗死主要是突發(fā)的持續(xù)性缺血缺氧所導(dǎo)致。發(fā)生心肌梗死的時(shí)候會(huì)損傷大量的心肌細(xì)胞[3]。同時(shí)每年由于人體正常的新陳代謝與老化，心肌細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性的損失[4]，因此針對(duì)心肌細(xì)胞壞死機(jī)制的研究顯得非常重要。

2006年ARAVIN等[5]從C57小鼠輸精管中分離出一種新型非編碼小RNA，并發(fā)現(xiàn)其可以與PIWI亞家族蛋白發(fā)生互作，遂將此類小RNA命名為piRNA。piRNA 3′端存在甲基化修飾，5′端第一個(gè)核苷酸存在尿嘧啶偏向性，同時(shí)第10位的堿基存在腺嘌呤偏向性[6]；piRNA通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子，在生殖系統(tǒng)中表達(dá)水平很高[7]；piRNA主要分布在常染色體上，極少一部分分布于X、Y染色體上[8]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)piRNA在細(xì)胞衰老、心血管系統(tǒng)疾病、癌癥等眾多疾病中均扮演著重要的角色[9-11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，piRNA可以通過介導(dǎo)mRNA表觀遺傳修飾參與調(diào)節(jié)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程[7]。但目前對(duì)于piRNA在心肌細(xì)胞壞死過程中的作用機(jī)制尚不清楚。piR-10555已被現(xiàn)有基因庫收錄，編號(hào)DQ542443。本研究通過過表達(dá)或敲低H9c2細(xì)胞piR-10555基因，探討piR-10555在H9c2細(xì)胞壞死過程中變化情況及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑來源

大鼠心肌細(xì)胞H9c2為本實(shí)驗(yàn)室保存；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYRB試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；siRNA及陰性對(duì)照NC購(gòu)自吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LDH測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為0.10血清及10 g/L的青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下傳代培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板中，孵育12～48 h后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞壞死誘導(dǎo)處理 以500 μmol/L H2O2處理H9c2細(xì)胞0、6、12、24 h，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)進(jìn)行[12]。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法篩選出H9c2細(xì)胞piR-10555表達(dá)差異有顯著性的時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)間。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

本研究通過分別向細(xì)胞不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染NC以及轉(zhuǎn)染agomir-piR-10555將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(A組)、NC組(B組)、過表達(dá)piR-10555組(C組)。使用RT-qPCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中piR-10555的相對(duì)表達(dá)水平(U6作為內(nèi)參照)，通過PI染色及LDH試劑盒測(cè)量各組細(xì)胞的壞死情況,實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

通過分別向細(xì)胞不轉(zhuǎn)染、僅H2O2處理以及轉(zhuǎn)染NC后H2O2處理、轉(zhuǎn)染antagomir-piR-10555后H2O2處理將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(D組)、H2O2處理組(E組)、NC+H2O2處理組(F組)以及敲低piR-10555+H2O2處理組(G組)。使用RT-qPCR方法檢測(cè)4組細(xì)胞中piR-10555的相對(duì)表達(dá)水平(U6作為內(nèi)參照)，通過檢測(cè)PI陽性染色比例及細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH的活性來測(cè)量細(xì)胞壞死情況，實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 H2O2處理的不同時(shí)間點(diǎn)H9c2細(xì)胞中piR-10555的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2處理H9c2細(xì)胞0、6、12以及24 h后，piR-10555表達(dá)水平分別為1.00±0.23、1.27±0.27、1.75±0.64、2.91±0.25，不同時(shí)間H9c2細(xì)胞中piR-10555表達(dá)差異有顯著性(F=14.51，P<0.05)；其中24 h與0 h進(jìn)行比較，H9c2細(xì)胞中piR-10555表達(dá)水平具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 piR-10555對(duì)H9c2細(xì)胞壞死的調(diào)控作用

2.2.1過表達(dá)piR-10555對(duì)H9c2細(xì)胞壞死的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組H9c2細(xì)胞中piR-10555表達(dá)水平、PI陽性率及細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性比較差異有顯著性(F=32.61～154.00，P<0.05)，其中C組以上指標(biāo)與A、B組比較，差異均有顯著意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組H9c2細(xì)胞內(nèi)piR-10555表達(dá)水平及細(xì)胞壞死情況比較

2.2.2敲低piR-10555對(duì)H9c2細(xì)胞壞死的影響敲低實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組H9c2細(xì)胞中piR-10555表達(dá)水平、PI陽性率及細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性比較差異具有顯著性(F=33.31～138.70，P<0.05)，其中G組與E、F組比較，差異均有顯著意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 敲低實(shí)驗(yàn)各組H9c2細(xì)胞內(nèi)piR-10555表達(dá)水平及細(xì)胞壞死情況比較

3 討 論

心肌細(xì)胞的死亡是許多心臟疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)[13]。長(zhǎng)期以來壞死被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的最主要的方式之一。過去的觀點(diǎn)中認(rèn)為壞死不受信號(hào)通路調(diào)控，是被動(dòng)的細(xì)胞死亡形式[14]。但隨著研究不斷深入，近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死也是一個(gè)由基因控制的高度有序的在一系列酶參與下完成的過程[15]。細(xì)胞壞死能夠幫助機(jī)體維持正常的生理功能，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[16]。然而，目前對(duì)于心肌細(xì)胞壞死的信號(hào)通路的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入，因此針對(duì)心肌細(xì)胞壞死的分子機(jī)制進(jìn)行研究,并以此開發(fā)新的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)具有重要意義。

A、B、C分別為A、B、C組，400倍圖1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞PI染色結(jié)果

D、E、F、G分別為D、E、F、G組，400倍圖2 敲低實(shí)驗(yàn)各組PI染色結(jié)果

隨著表觀遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的興起與發(fā)展，曾被認(rèn)為是無用基因的非編碼基因已成為研究的前沿領(lǐng)域，近年來非編碼RNA也已經(jīng)成為了心血管疾病研究的熱點(diǎn)[17]。雖然piRNA在心臟組織中大量表達(dá)，但是其參與心臟相關(guān)各種疾病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[18]。piRNA可以通過與PIWI蛋白形成RNA-蛋白復(fù)合物參與基因調(diào)控[19]。在心肌細(xì)胞從多能細(xì)胞分化而來的過程中，可以觀察到動(dòng)態(tài)而特異的piRNA表達(dá)模式[20]。與正常的心臟相比，發(fā)生心肌細(xì)胞肥大的心臟組織中piRNA的表達(dá)水平異常，但其功能仍不清楚[21-22]。在生殖細(xì)胞中，piRNA與PIWI蛋白一起介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子和編碼蛋白基因的調(diào)控[23]。而piRNA在調(diào)控心肌細(xì)胞壞死過程中的具體作用機(jī)制研究目前還比較匱乏，所以尋找心臟組織中特異表達(dá)的并且參與調(diào)控心肌細(xì)胞死亡的piRNA，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，具有重要的研究意義。

本研究通過建立H9c2細(xì)胞的壞死模型，探討piRNA在心肌細(xì)胞壞死中的機(jī)制及作用。本次實(shí)驗(yàn)中所使用的agomir-piR-10555、agomir-NC-piR-10555、antagomir-piR-10555以及antagomir-NC-piR-10555為相關(guān)siRNA，通過將其轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，以達(dá)到過表達(dá)或敲低piR-10555的目的。PI能夠標(biāo)記發(fā)生壞死的細(xì)胞核，被作為一種常見的壞死檢測(cè)方式。細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)，胞質(zhì)酶LDH釋放到細(xì)胞外，通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性也可作為檢測(cè)細(xì)胞壞死的一個(gè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H2O2處理24 h后，H9c2細(xì)胞中piR-10555的表達(dá)水平顯著升高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇24 h作為細(xì)胞處理時(shí)間點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染agomir-piR-10555后H9c2細(xì)胞內(nèi)piR-10555的表達(dá)水平顯著升高；通過PI染色發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)piR-10555后PI陽性率相對(duì)于A、B組顯著升高；LDH活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)piR-10555后細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH活性相對(duì)于A、B組顯著升高。提示，過表達(dá)piR-10555后可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生壞死。轉(zhuǎn)染antagomir-piR-10555后，H9c2細(xì)胞內(nèi)piR-10555表達(dá)明顯下降；通過PI染色發(fā)現(xiàn)，敲低piR-10555后，G組的PI陽性率相對(duì)于E、F組顯著降低；LDH活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲低piR-10555以后，G組的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH的活性相對(duì)于E、F組顯著降低。提示，敲低piR-10555可以抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的壞死。

綜上所述，piR-10555能夠參與調(diào)控由H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的壞死。但piR-10555調(diào)控心肌細(xì)胞壞死的具體機(jī)制還有待深入研究。