碳酸鹽脅迫對瓦氏雅羅魚血液中部分生理生化指標的影響

徐悅，米博瀚，趙雪飛，黃晶，梁利群

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；3.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

瓦氏雅羅魚是我國北方知名的土著魚，隸屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科的雅羅魚屬，亦稱東北雅羅魚，俗稱華子魚、滑魚、白魚，主要分布在黑龍江流域的各個水系，此外，黃河的下游、灤河、岱海以及內蒙古的達里湖等地亦有分布。內蒙古達里諾爾湖的瓦氏雅羅魚可以耐受堿度53.57 mmol/L、pH 高達9.69 的惡劣水質條件[1]。竇新杰等[2]對瓦氏雅羅魚的COI 序列分析可知，達里諾爾湖瓦氏雅羅魚與黑龍江流域的松花江瓦氏雅羅魚雖然親緣較近，但已出現明顯分化。生存于不同鹽堿環境下的雅羅魚，也使培育耐鹽堿養殖新品種成為可能。

鹽堿水是分布于陸地區域、礦化度大于1 g/L小于50 g/L 的非海洋性咸水資源，在自然界廣泛存在，具有高pH、高碳酸鹽堿度、主要離子比例失衡、水質類型多等特點。由于人畜無法飲用，農業無法直接利用，絕大多數處于閑置狀態。開發鹽堿水養殖，對節約利用土地資源，保證內陸水產養殖可持續發展具有重要意義[3]。水環境對于魚類的血液循環系統有直接影響，魚類的血液指標是反應魚類生理活動和健康狀態的重要參數。研究堿脅迫下瓦氏雅羅魚血液生理指標的變化情況，有助于探究瓦氏雅羅魚在堿脅迫下的生理變化。

本實驗以堿水、淡水瓦氏雅羅魚為研究對象，分別于30 mmol/L 與50 mmol/L 的NaHCO3溶液堿度水環境進行20 d 耐受試驗。通過研究不同濃度堿脅迫對瓦氏雅羅魚堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨（Amon）和乳酸脫氫酶（LDH）含量變化的影響，探討不同瓦氏雅羅魚在堿脅迫下生理指標變化情況，為探索雅羅魚耐堿機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗魚為分別采自內蒙古達里諾爾湖的瓦氏雅羅魚（堿水組）F1親本和松花江瓦氏雅羅魚（淡水組）F1，共計120 尾。堿度耐受實驗前實驗魚在循環可控水族箱（42.6 cm×28.4 cm×29.3 cm）暫養1 周。

1.2 堿脅迫實驗

實驗用水為過濾、曝氣24 h 的自來水，水溫為（20.5±1.5）℃，pH7.25，溶解氧為（7.5±0.42）mg/L，氨氮為0.26 mg/L。實驗魚以5 尾一組，分別置于0 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L 的碳酸鹽堿水中。每組3 個平行試驗，實驗開始后每天測兩次水質，并視水質情況換水，保持碳酸鹽堿度恒定，氨氮氣低于3 mg/L，耐受20 d 后取血液。

1.3 血液的采集與檢測

堿脅迫實驗20 d 后采集樣品。用1 mL 無菌注射器從實驗魚尾靜脈采血，置于無菌離心管中，4℃靜置12 h，3 500 r/min 離心15 min，取上層血清置于-20℃低溫冰箱保存備用。血清中堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨和乳酸脫氫酶（LDH）的酶活測定均使用南京建成科技有限公司生產的試劑盒，利用Bio-Tek Synergy2多功能酶標儀測定[4]。

1.4 數據的測定

數據處理以堿濃度單素方差分析（One-Way ANOVA），用LSD 多重比較法進行組間差異顯著性檢驗。試驗數據以平均值±標準誤（Mean±SD）表示，采用SPSS19.0 軟件包進行統計分析，顯著性水平取α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 堿脅迫對堿性磷酸酶的影響

經20 d 堿脅迫，與對照組相比，FW 與AW 血清中堿性磷酸酶活性均有一定程度升高，FW 與AW 均在30 mmol/L 堿度下堿性磷酸酶活性高于50 mmol/L 堿度。FW 血清中AKP 活性（9.71±0.17、13.18±1.38 和12.4±0.52）與AW（10.56±0.45、8.72±0.83 和11.59±0.30）均為堿脅迫組高于對照組，AW 與FW 的血清AKP 活性在30 mmol/L 時在統計學上差異顯著（P＜0.05），兩個種群各實驗組內AKP 活 性 差 異 均 不 顯 著（P ＞0.05）；FW 的30 mmol/L 和50 mmol/L 堿度處理與對照組相比差異均顯著（P＜0.05），AW 在兩個堿度處理組間差異不顯著（P＞0.05），但均與對照組存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各實驗組堿性磷酸酶變化情況Fig.1 Changes of AKP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.2 堿脅迫對酸性磷酸酶的影響

兩個種群魚血清中酸性磷酸酶變化情況與堿性磷酸酶有所不同。與對照組相比，FW 在堿脅迫后，血清中ACP 活性一定程度降低，且50 mmol/L堿處理組（91.41±3.75）要低于30 mmol/L 堿處理組（97.4±15.69），但兩處理組與對照組均不存在顯著差異（P＞0.05）；AW 則與FW 相反，兩個堿處理組血清中ACP 活性均一定程度升高，50 mmol/L 處理組（107.15±4.24）低于30 mmol/L 處理組（117.39±10.22），僅30 mmol/L 組與對照組存在顯著差異（P＜0.05）；相同實驗組中，僅30 mmol/L 處理組中，兩個種群魚的血清ACP 含量差異顯著（P＜0.05），其余均不存在顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各實驗組酸性磷酸酶變化情況Fig.2 Changes of ACP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.3 堿脅迫對尿素氮的影響

20 d 堿度脅迫下，FW 和AW 的尿素氮變化情況相似，均為30 mmol/L 處理組尿素氮含量（5.73±0.78 和18.71±3.53）高于50 mmol/L 處理組（3.95±0.51 和13.97±0.79），但AW 波動幅度遠大于FW，兩個處理組AW 的血清BUN 含量均接近FW 的4倍；FW 的兩個處理組與對照組間不存在顯著差異（P＞0.05），AW 則均與處理組存在顯著差異（P＜0.05）；同一堿度處理下，AW 與FW 也都存在顯著差異（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各實驗組尿素氮變化情況Fig.3 Changes of BUN in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.4 堿脅迫對血氨的影響

兩個種群魚血清的血氨變化情況相似，均為處理組高于對照組，30 mmol/L 組（1919.93±63.92 和1638.58±178.72）高于50 mmol/L 組（1599.86±159.32 和1400.27±61.76），且FW 均高于AW；各實驗組內，僅30 mmol/L 組中兩個種群魚血清的血氨含量存在顯著差異（P＜0.05），FW 和AW 的兩個處理組均與對照組存在顯著差異（P＜0.05），FW 的兩個處理組間也存在顯著差異（P＜0.05），AW 的兩個處理組間則不存在顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各實驗組血氨變化情況Fig.4 Changes of blood ammonia in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.5 堿脅迫對乳酸脫氫酶的影響

堿度脅迫下，FW 與AW 血清中的乳酸脫氫酶變化幅度均不明顯。3 個實驗組間的LDH 含量均不存在顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各實驗組乳酸脫氫酶變化情況Fig.5 Changes of LDH in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

3 討論

3.1 碳酸鹽脅迫對瓦氏雅羅魚血液中磷酸酶的影響

水體中的碳酸鹽堿度對水生生物的多個生理進程都有影響，主要表現在組織功能、消化酶和免疫相關酶活性等方面。通常環境中的脅迫因素會導致魚類出現應激反應，應激反應開始于組織和器官功能的變化，是生物應對或補償脅迫源，從而導致遠離穩態的生理反應，這種反應的速率或幅度在不同的個體之間可能存在差異，但其機制具有相似的特征[4]。ACP 是溶酶體的標志性酶，磷酸基團代謝產物通過磷酸酶進行轉化和代謝，AKP 為ADP 轉化為ATP 提供無機磷酸，是反映生物體免疫機能與健康狀況的指標[5]。

本實驗中，在高堿度條件下，淡水種與堿水種瓦氏雅羅魚血清中的堿性磷酸酶活性均顯著升高，說明兩種瓦氏雅羅魚均通過提高機體ACP 酶活性以適應高堿度環境。這與趙麗慧[6]、王卓等[7]的研究結果類似。研究發現，在50 mmol/L 組的磷酸酶活性要低于30 mmol/L，這可能是由于高堿脅破下瓦氏雅羅魚為調節代謝所消耗的能量更多，機體所需的ATP 升高消耗了磷酸酶，從而導致了50 mmol/L 組瓦氏雅羅魚的AKP 與ACP 低于30 mmol/L 處理組。舒超華等[8]在研究紅耳龜鹽脅迫下的生理指標中也有相似的效果。血清中的ACP 酶活力在30 mmol/L耐受升高后在50 mmol/L 處略微下降，說明在更高的50 mmol/L 堿脅迫下，ACP 酶活性被抑制。淡水種瓦氏雅羅魚的ACP 在高堿度下要顯著高于堿水種瓦氏雅羅魚，說明堿水種相對于淡水種瓦氏雅羅魚對碳酸鹽堿度的適應性較強，高堿度脅迫下磷酸酶活性也具有很好的恢復功能。

3.2 碳酸鹽脅迫對瓦氏雅羅魚血液中尿素氮、血氨和乳酸脫氫酶的影響

尿素氮是動物體內蛋白質代謝的主要代謝產物，可以反映腎臟的健康狀況。血清中尿素氮是衡量動物體內蛋白質代謝和氨基酸平衡的一個重要指標。通常，較低的BUN 含量表明氨基酸平衡較好，機體蛋白質合成率較高[9]，血清尿素氮過高，則會使氮通過尿液排出體外[10]。

有研究表明在碳酸鹽水體中，魚體內外離子濃度的變化會導致體內NH4+的堆積[11,12]。本研究中，與0 mmol/L 堿度環境下相比，兩種瓦氏雅羅魚在30 mmol/L 和50 mmol/L 堿度下尿素氮均顯著增長，且堿水種瓦氏雅羅魚的尿素氮數值顯著高于淡水種雅羅魚。與張曉瑩等[13]發現異育銀鯽在高氨氮環境下異尿素氮數值顯著升高的研究類似。魚體內的氨經氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）催化產生氨甲酰磷酸等一系列生化反應，最終產生尿素[14,15]。常玉梅等[16]測定了不同堿度下瓦氏雅羅魚血漿游離氨基酸的變化，發現達里湖雅羅魚在高堿脅迫下血漿中非必需氨基酸的含量隨著堿度的升高,呈明顯上升趨勢，說明其蛋白代謝受到了高堿度的影響。賴氨酸的含量與水體堿度呈現“U”形關系，即30 mmol/L堿度組含量低于對照組和高堿度組50 mmol/L，而血清尿素氮則呈現“倒U”形。說明血清尿素氮含量可能與某幾種氨基酸的合成或代謝有一定的聯系。

魚類鹽堿代謝的基礎是排氨[17]，相比較于淡水種雅羅魚，堿水種雅羅魚血液中的氨明顯低于淡水種，且尿素氮高于淡水種雅羅魚。說明堿水種通過尿液向體外排除氮的能力要明顯強于淡水種，堿水種能通過這一方式減少體內部分有害氮的堆積，使自身對外界惡劣環境具有更強的適應能力。此外，兩種雅羅魚在50 mmol/L 堿度下尿素氮和血氨也出現了的低于30 mmol/L 的情況。何強等[18,19]研究的測定類似，堿水雅羅魚的血氨含量在兩個處理組中雖然有一定的波動，但并不存在顯著差異（P＞0.05），而淡水雅羅魚兩個處理組相互之間存在顯著差異（P＜0.05），血氨含量波動較大，說明堿水種能夠通過保持體內一定范圍的氨氮含量適應高鹽堿環境，而淡水種則欠缺這種適應能力。

乳酸脫氫酶是生物體糖代謝無氧酵解過程中重要的調節酶，可催化無氧酵解產生的乳酸與丙酮酸之間的相互轉化。在相關的研究中，陶易凡等[20]研究表明，短期的高pH 脅迫會使克氏原螯蝦Procambarus clarkia LDH 酶活性升高。崔東遙等[21]對中間球海膽Strongylocentrotus intermedius 面對海水酸化的實驗發現，中間球海膽通過調節SiLDH 基因的表達和LDH 活性來緩解海水酸化帶來的負面影響。本實驗中瓦氏雅羅魚乳酸脫氫酶活性變化不顯著，有可能是瓦氏雅羅魚的耐堿機制使乳酸脫氫酶活性保持穩定，但是不能從結果推斷兩種瓦氏雅羅魚的生理機制相同，乳酸脫氫酶在瓦氏雅羅魚耐堿方面的功能有待進一步研究。

3.3 結論

碳酸鹽脅迫對于瓦氏雅羅魚血液中的磷酸酶活性、血氨和尿素氮含量有明顯的影響。在堿脅迫條件下，兩種雅羅魚堿性磷酸酶活性顯著高于淡水對照，堿水雅羅魚酸性磷酸酶活性顯著升高，淡水雅羅魚變化不明顯。推斷磷酸酶參與堿水雅羅魚的耐堿機制。堿脅迫下堿水雅羅魚尿素氮指標顯著升高，淡水雅羅魚尿素氮指標變化不顯著，另外兩者血氨指標均有升高。推斷堿水雅羅魚應對堿脅迫啟動排氨代謝導致尿素氮升高，而淡水雅羅魚血氨升高尿素氮不升高使其體內有害氮堆積有可能會造成損傷。

綜上所述，堿水雅羅魚和淡水雅羅魚對于碳酸鹽脅迫的應激性和適應能力有一定的不同，達里湖瓦氏雅羅魚可能會啟動一些特殊的機制來應對高堿度水環境。達里湖瓦氏雅羅魚對高堿水的適應能力強于松花江瓦氏雅羅魚。