嗜冷黃桿菌培養基優化研究

柴靜茹，盧彤巖，王荻，陳福廣，李紹戊

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

隨著產業規模化程度的提高，養殖鮭鱒魚患病死亡風險大幅提高。細菌性冷水病（Bacterial coldwater disease,BCWD）是一種廣泛流行的細菌性疾病，患病鮭鱒的死亡率為10%～90%，給鮭鱒產業帶來嚴重經濟損失[1]。BCWD 的病原嗜冷黃桿菌Flavobacterium psychrophilum 呈革蘭氏陰性，細長桿狀，直徑0.20～0.75 μm，長1.5～7.5 μm，具有圓形末端，雖無鞭毛或菌毛，但能產生滑動運動，最佳培養溫度為15～18℃[2-6]。嗜冷黃桿菌宿主譜廣泛且主要感染鮭科魚類，目前已報道感染的鮭科魚類有虹鱒Oncorhynchus mykiss、銀鮭O.kisutch、大鱗鮭O.stshawytscha、山鱒O.clarkii、北極紅點鮭Salvelinus alpinus、湖紅點鮭S.namaycush、大西洋鮭Salmo salar、海鱒Salmo trutta trutta 和褐鱒Salmo trutta lacustris 等，其中虹鱒和銀鮭最易感[7]。第一株嗜冷黃桿菌分離自美國，現已分布世界，在全球多個國家和地區的養殖或野生魚類中均有報道[8,9]。

嗜冷黃桿菌屬需氧菌，對營養和培養條件要求很苛刻，通常在腦心浸液瓊脂、胰蛋白酶大豆瓊脂、三糖鐵瓊脂和血瓊脂等高營養濃度的培養基上不生長[7]。關于嗜冷黃桿菌增殖培養基的報道較多。最早用于分離嗜冷黃桿菌的培養基是Cytophaga 培養基，由0.05%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%乙酸鈉和0.02%牛肉提取物配制而成（pH 7.0～7.2）[10]。Obach 等[11]在Cytophaga 培養基中加入10%胎牛血清促進了嗜冷黃桿菌的生長，但胎牛血清成本較高。Daskalov 等[12]利用Cytophaga 培養基作為基礎培養基，加入0.5 g/L 的D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脫脂牛奶，在改良培養基上得到的菌落尺寸比單用Cytophaga 培養基大一倍，嗜冷黃桿菌的生長速度更快，產菌量更高，但也只達到106CFU/mL。目前科研領域使用最廣泛的是胰蛋白酵母提取物培養基（tryptone yeast extract salts,TYES）的配方是：0.4%胰蛋白胨、0.04%酵母提取物、0.05%七水硫酸鎂、0.05%無水氯化鈣（pH 7.2）[13]。然而使用TYES培養基培養時間較長，一般需要至少4 d。本實驗以TYES 培養基為基礎，嘗試篩選一種培養時間短、產菌量高、活力好、成本低及制備方法操作簡單的嗜冷黃桿菌培養基。

1 材料與方法

1.1 材料

供試嗜冷黃桿菌CH06 株、CH07 株和CH08 株由本實驗室分離自臨床患病虹鱒的病灶及脾臟，并鑒定和保存。健康虹鱒購自遼寧本溪艾格莫林有限公司，平均體質量20～30 g。

TYES 液體培養基的制備：1 L 蒸餾水，4 g/L 胰蛋白胨，0.5 g/L 酵母提取物，0.2 g/L 無水氯化鈣，0.5 g/L 七水硫酸鎂，pH 調至7.2，121℃高壓滅菌15 min。Biolog GEN III 微平板、接種液No.72401-IF-A和無菌一次性接種棉簽購自美國BIOLOG 公司；L-脯氨酸購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 碳源的篩選

通過Biolog 微平板法確定嗜冷黃桿菌利用率最高的碳源。Biolog Gen III 96 孔微平板含71 種碳源、23 種化學敏感物質及陰性和陽性對照。將-80℃凍存的嗜冷黃桿菌CH06、CH07 和CH08 株于TYES 固體培養基上劃線復蘇，18℃恒溫培養箱中倒置培養，直至長出單菌落且沒有雜菌。

將Biolog Gen III 96 孔微平板從4℃冰箱中取出，室溫條件下放置30 min，擦干凈接種管外壁，放入濁度儀中，將濁度儀透光度調至100%，用無菌一次性接種棉簽蘸取單菌落，放入接種液中攪拌，使菌落均勻分散，制成濁度為90%～98%T 的懸濁液，加入Biolog Gen III 96 孔板中，每孔100 μL。每隔24 h 使用酶標儀讀取每個孔在590 nm 和750 nm波長下的吸光度值，連續讀取7 d。以Gen III 微平板的A10 孔為對照，其他孔的吸光度值小于A10 孔的一半，定為“陰性”反應；其他孔的吸光度值大于A10 孔一半，定為“陽性”反應[14]。陽性反應的碳源為可利用碳源。微生物對不同碳源的利用能力，用顏色平均變化率（Average Well Color Development，AWCD）表示，計算菌株的AWCD 值隨時間的變化，得到其利用碳源的平均活性[15]。

1.2.2 單因素試驗

初步篩選出利用率最高的碳源后，進一步研究該碳源添加濃度對嗜冷黃桿菌增殖的影響，以確定最佳添加濃度。設置碳源的添加濃度分別為0.3 g/L、0.5 g/L 和1.0 g/L，將方法1.2.1 中復蘇的嗜冷黃桿菌CH06 株按1∶100 的比例分別接種到TYES液體培養基、TYES+0.3 g/L 碳源液體培養基、TYES+0.5 g/L 碳源液體培養基和TYES+1.0 g/L 碳源液體培養基中，每組3 個重復，18℃150 r/min 震蕩培養，每隔24 h 利用平板計數法計算菌落數量。隨后選取CH07 和CH08 株進行結果驗證。

1.2.3 添加碳源對菌落形態的影響

為比較各組不同配方培養基上生長的嗜冷黃桿菌形態有無差異，分別利用革蘭氏染色和掃描電鏡方法比較菌落的形態和大小。

1.2.4 添加碳源對菌株致病性的影響

為比較添加碳源培養基與TYES 培養基上生長的嗜冷黃桿菌毒力差異，給實驗魚尾柄肌肉按0.1 mL/尾的劑量注射菌懸液。菌懸液的初始濃度為1×108CFU/mL，每組10 尾。注射后每日投喂兩次，投餌量為體質量的1.0%，每天記錄臨床癥狀和死亡情況，取瀕死或死亡的實驗魚病灶及內臟器官進行細菌再分離和鑒定。空白對照組實驗魚注射等劑量的TYES 液體培養基。

1.3 數據分析

實驗數據采用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）,多重比較采用Duncan’s法，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 三株嗜冷黃桿菌對碳源的利用情況

Biolog 分析結果表明，三株嗜冷黃桿菌的陽性反應很明顯，對鑒定板中碳源的利用情況不完全相同。由圖1 可知，CH06 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龍膽二糖和奎寧酸；CH07 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺和乙酸；CH08 株能夠利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、葡糖醛酰胺、乙酸、L-組胺和L-蘋果酸。

圖1 三株嗜冷黃桿菌在GEN III 微平板上的反應Fig.1 Reactions of 3 strains of F.psychrophilum on GEN III microplates

三株嗜冷黃桿菌的碳源利用隨時間而變化。AWCD 值分析結果表明，菌株CH06 株在培養初始階段對L-脯氨酸的利用率最高，且持續到碳源消耗殆盡；對L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龍膽二糖和奎寧酸也有利用，但是利用率顯著低于L-脯氨酸（圖2-A）。CH07 株在前24 h 對葡糖醛酰胺的利用率最高；從24 h 開始，CH07 株對L-脯氨酸的利用率持續增高，48 h 及以后利用率顯著高于L-谷氨酸、L-組胺、葡糖醛酰胺和乙酸（圖2-B）。在培養初始階段，CH08 株能利用葡糖醛酰胺、L-谷氨酸、乙酸和L-脯氨酸，48 h 才開始利用L-組胺，72 h 開始利用L-蘋果酸（圖2-C）。結果表明，嗜冷黃桿菌對碳源的利用效率由高至低依次為：L-谷氨酸＞L-脯氨酸＞葡糖醛酰胺＞乙酸＞L-蘋果酸＞L-組胺。

圖2 三株嗜冷黃桿菌對不同碳源的利用率隨時間的變化Fig.2 Changes in utilization of carbon sources by three strains of F.psychrophilum with time

2.2 單因素試驗

對不同碳源的利用表明，三株嗜冷黃桿菌對L-脯氨酸的利用率最高。因此，進一步比較了該碳源不同添加劑量對嗜冷黃桿菌CH06 株生長的影響。由表1 可知，CH06 株在添加不同濃度L-脯氨酸的TYES 培養基上生長24 h 后，細菌濃度達到8×106CFU/mL，顯著高于TYES 組（P＜0.05）；48 h 時，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 組的細菌濃度為3.5×107CFU/mL，分別是1.0 g/L、0.3 g/L L-脯氨酸TYES 組和TYES 組的1.59 倍、1.94 倍和11.67 倍；72 h 時，TYES 組的活菌數量降低，而實驗組的活菌數量持續升高，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 組的菌液濃度達5×107CFU/mL，是1.0 g/L 和0.3 g/L L-脯氨酸TYES組的2.50 倍，是TYES 組的250 倍。

表1 不同培養基對嗜冷黃桿菌CH06 株生長的影響Tab.1 Effects of different media on the growth of CH06 strain

2.3 CH07 株和CH08 株驗證添加碳源的最佳濃度

在添加0.5 g/L L-脯氨酸的TYES 培養基上，嗜冷黃桿菌CH07 和CH08 株的生長結果表明（表2），CH07 和CH08 株在添加L-脯氨酸的培養基上培養24 h、48 h 和72 h 后，細菌濃度顯著升高，高于TYES 對照組，與CH06 株結果一致。

表2 不同培養基對嗜冷黃桿菌CH07、CH08 株生長的影響Tab.2 Effects of different media on the growth of CH07 and CH08 strains

2.4 L-脯氨酸對嗜冷黃桿菌菌落形態的影響

染色結果表明（圖3），在TYES 基礎培養基和添加L-脯氨酸的TYES 培養基培養的三株嗜冷黃桿菌均為革蘭氏陰性細長桿菌，形態無明顯變化。掃描電鏡觀察顯示，在TYES 基礎培養基上生長的嗜冷黃桿菌平均長度為（1.83±0.22）μm，平均直徑為（0.25±0.03）μm；在添加L-脯氨酸的TYES 培養上生長的嗜冷黃桿菌平均長度為（1.84±0.2）μm，平均直徑為（0.25±0.02）μm。不同培養基上生長的嗜冷黃桿菌在形態和規格上無差異（圖4）。

圖3 革蘭氏染色觀察CH06 株形態變化Fig.3 The morphological observation of CH06 strain by Gram staining

圖4 掃描電鏡觀察CH06 株形態變化Fig.4 The morphological observation of CH06 strain under a scanning electron microscope

2.5 L-脯氨酸對嗜冷黃桿菌致病性的影響

人工感染試驗結果表明，在添加L-脯氨酸的TYES 培養基上培養的CH06、CH07 和CH08 株對虹鱒幼魚均具有較強的致病性。試驗魚在攻毒48～72 h 后行動萎靡、食欲不振，注射處開始膿腫潰爛；剖檢可見鰓蒼白、肝臟蒼白和脾臟腫大，伴有腸炎。與TYES 培養基上生長的嗜冷黃桿菌相比，添加L-脯氨酸培養的CH06、CH07 和CH08 株感染虹鱒后引發的臨床病征出現時間和死亡率等均無顯著差異。對照組魚僅在肌肉注射處有輕微腫脹，無其他臨床癥狀且無死亡（圖5）。從人工感染試驗魚脾臟及注射肌肉處均分離到嗜冷黃桿菌。

圖5 虹鱒幼魚感染嗜冷黃桿菌后臨床病征Fig.5 Clinical symptoms in juvenile rainbow trout infected with F.psychrophilum

3 討論

鮭鱒魚病原體嗜冷黃桿菌的培養難度較大，一是需要在低營養濃度的培養基上生長，二是需要較長的培養時間。面對嗜冷黃桿菌引起的BCWD 發病機制的研究和疫苗的大規模生產這兩大問題，急需研發一種培養時間短、產菌量高、成本低及制備方法操作簡單的嗜冷黃桿菌培養基。國外已經報道過幾種改良的嗜冷黃桿菌培養基，除了Cytophaga 培養基，還有一種富含胰蛋白胨的基礎培養基，即Anacker-Ordal 肉湯，其配方為：0.5%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%牛肉提取物和0.02%乙酸鈉[2]。Daskalov 等[12]以Cytophaga 培養基為基礎培養基，添加D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脫脂牛奶，培養嗜冷黃桿菌后盡管細菌量增多，也只有106CFU/mL。Crump 等[17]開發了胰蛋白酵母提取物麥芽糖培養基。Oplinger 等[17]研究表明，添加0.2%脫脂牛奶和1%馬血清可以促進嗜冷黃桿菌增殖，提高培養效果，二者豐富了培養基的蛋白質含量，增加了嗜冷黃桿菌可用蛋白質來源的多樣性，但馬血清成本較高，且脫脂牛奶和馬血清都需要過濾滅菌，操作不夠便捷。Cepeda 等[18]在TYES 基礎上，添加0.5 g/L 葡萄糖，培養的嗜冷黃桿菌在穩定期能達到5×109CFU/mL，高于TYES培養基（2×108CFU/mL）和CCM培養基（3×107CFU/mL）。嗜冷黃桿菌一直被認為是一種無法利用碳水化合物的細菌，葡萄糖在生長中的作用尚無法解釋，有待深入研究[19]。

Biolog Gen III 96 孔微平板含碳源種類豐富，71種碳源中有單糖類、磷酸己糖類、氨基酸類、己糖酸類、羧酸類、酯類和脂肪酸類。本研究用Biolog Gen III 微平板法篩選適合添加及利用率最高的碳源。結果表明，氨基酸類中的L-脯氨酸為嗜冷黃桿菌CH06 和CH07 株利用率第一的碳源，為CH08 株利用率第二的碳源，綜合三株菌利用碳源的情況選用L-脯氨酸作為添加碳源。

L-脯氨酸是一種結構與性質獨特的生物蛋白質氨基酸，為亞氨基酸，分子量較小，水溶性比任何氨基酸都大，能發揮多方面生理功能。據報道，L-脯氨酸的積累與細菌滲透脅迫耐受性密切相關。Csonka[20]研究表明，鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium 的L-脯氨酸高產菌株獲得了滲透抗性；Zaprasis 等[21,22]研究發現，枯草芽孢桿菌Bacillus subtlis 可積累胞內L-脯氨酸，對抗高滲透壓的脅迫。劉玉霞等[23]最新研究發現：耐氧突變株Clostridium sp.Aeroto-AUH-JLC108 在有氧條件下生長時，獲得了積累脯氨酸的能力，所以在相同接種條件下，在有氧條件下耐氧突變株的生長速度明顯快于原出發菌株，生物量是原出發菌株在厭氧條件下的2～3 倍。這些研究結果或許能作為L-脯氨酸在嗜冷黃桿菌培養中發揮作用的依據。

盡管已有研究通過改良嗜冷黃桿菌培養基而提高了產菌量，但是缺乏改良培養基對菌株形態、大小和致病性影響的分析。本研究對TYES 培養基添加L-脯氨酸后培養的嗜冷黃桿菌進行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察，發現仍為細長、兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，平均長度和直徑與TYES 培養基培養的該菌幾乎沒有差異，也在文獻報道范圍內。為了判斷改良培養基是否影響嗜冷黃桿菌毒力，本研究用嗜冷黃桿菌人工感染了虹鱒幼魚，出現臨床癥狀的時間、死亡率與對照組無明顯差異，說明改良培養基不影響該細菌的毒力。本研究結果對于嗜冷黃桿菌的體外培養及規模化生產具有重要指導意義。