hCG日孕酮過高或過低對年輕全胚冷凍患者周期累積活產(chǎn)率的影響

詹少泉 鄭海燕 曹明珠 劉見橋 毛玉玲 龍曉林 劉寒艷

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室（廣州510150）；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（杭州310003）

在常規(guī)的體外受精（IVF）周期中，人絨毛膜促性腺激素（hCG）給藥當(dāng)天的孕酮（P4）升高［1］對新鮮周期的子宮內(nèi)膜環(huán)境有不利影響［2］，導(dǎo)致妊娠率降低［1，3-4］。而hCG 日孕酮水平升高對卵母細(xì)胞或胚胎質(zhì)量的影響，存在爭議。有研究認(rèn)為，hCG日孕酮升高導(dǎo)致胚胎質(zhì)量受損［5-6］，降低累積活產(chǎn)率［7-8］，其他研究則認(rèn)為對胚胎質(zhì)量［1，4］和累積活產(chǎn)率均無影響［9］。此外，當(dāng)hCG 日孕酮水平過低（＜0.5 ng/mL）對新鮮周期活產(chǎn)率有影響［10-11］，但是對全凍周期活產(chǎn)率以及累積活產(chǎn)率的影響尚無相關(guān)報道。因此，本研究的目的是通過評估hCG 日孕酮水平過高或過低對年輕全胚冷凍患者凍融胚胎移植（FET）后累積活產(chǎn)率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2018年12月期間行全胚冷凍的周期，根據(jù)新鮮周期hCG 日孕酮水平的不同進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：取卵年齡≤35 歲，第1 次IVF 周期，拮抗劑方案或者激動劑方案。 排除標(biāo)準(zhǔn)：微刺激或自然周期，IVF+RICSI，IVF+ICSI 周期，PGT 周期，卵子冷凍周期，二次冷凍周期，未獲得活產(chǎn)但仍有凍存胚胎未移植者，失訪或結(jié)局指標(biāo)缺失者。同一組中每名患者只納入一次統(tǒng)計。該研究征得患者知情同意并獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。基線資料包括患者的取卵年齡、不孕年限、身高、體質(zhì)量指數(shù)、抗苗勒氏激素（AMH）、基礎(chǔ)FSH（bFSH）、基礎(chǔ)LH（bLH）、原發(fā)不孕比例以及不孕因素分布。

1.2 分組有研究認(rèn)為P4 ＞1.14 ng/mL時，新鮮移植會影響活產(chǎn)率［12］，而P4在0.5 ～1.2 ng/mL時，活產(chǎn)率最高［10-11］。參考既往研究［3-4］應(yīng)用的臨界值劃分，根據(jù)hCG日孕酮水平將3 923例患者分為四組：組1（＜0.50 ng/mL，n= 801），組2（0.50 ～1.14 ng/mL，n= 1 626），組3（1.15 ～1.49 ng/mL，n= 499）和組4（≥1.50 ng/mL，n=997）。組2 為對照組。

1.3 方法

1.3.1 卵巢刺激和胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)采用GnRH 激動劑方案或GnRH 拮抗劑方案［13］，當(dāng)至少兩個卵泡直徑＞17 mm 時，用4 000 ～10 000 IU 的hCG（麗珠，珠海麗珠）或重組HCG（艾澤，瑞士默克雪蘭諾）誘導(dǎo)最終的卵母細(xì)胞成熟。在hCG 日進(jìn)行孕激素測定，空腹取肘靜脈血5 mL，采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（雅培i4000SR）檢測。hCG 觸發(fā)后34 ～36 h 進(jìn)行卵母細(xì)胞采集。

第3 天冷凍胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)為：5 ～12 個細(xì)胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一或不完全均等大小，＜50%空泡，＜50%多核。第3 天優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為：7 ～9 個細(xì)胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一，無空泡或多核。根據(jù)患者情況以及知情同意，在第3 天冷凍0～4 個胚胎，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，在囊胚階段，根據(jù)Gardner 分類法在第5、6 天評估胚胎質(zhì)量。囊胚在3～6 級擴(kuò)張、ICM 和TE 的發(fā)育至少達(dá)到一個B 級或以上時冷凍。3 ～6 級，ICM 和TE均不含C 級時為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.3.2 FET 內(nèi)膜準(zhǔn)備、玻璃化冷凍和復(fù)蘇準(zhǔn)備冷凍胚胎移植的患者根據(jù)月經(jīng)和排卵情況采用自然周期或人工周期。玻璃化冷凍和復(fù)蘇采用商品化試劑盒（日本，加藤），卵裂胚冷凍在室溫下進(jìn)行，ES 液中5 min，VS 中45 ～60 s。囊胚在玻璃化冷凍之前，先進(jìn)行激光人工囊胚皺縮，冷凍過程在37 ℃下，ES 液中2 min，VS 中45 ～60 s。然后用最小體積的玻璃化溶液將胚胎裝載到冷凍載體Cryotop 頂端，并立即在-196 ℃下浸入液氮中。卵裂胚和囊胚復(fù)蘇過程相同，復(fù)蘇時，迅速將Cryotop頂端置于37 ℃的TS 中1 min，然后在室溫下依次將胚胎轉(zhuǎn)入DS、WS1、WS2 中各3 min。最后將存活的胚胎移入平衡過的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等待移植。培養(yǎng)2 ～4 h 后在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行宮內(nèi)移植。

1.4 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)包括新鮮周期卵巢刺激情況、胚胎培養(yǎng)情況以及全凍周期首次移植的活產(chǎn)率和累積活產(chǎn)率。活產(chǎn)，是指胚胎移植后在妊娠≥28 周時產(chǎn)下一個存活的嬰兒。累積活產(chǎn)，是指一次促排卵周期后的凍融移植周期獲得至少一次活產(chǎn)。至2020年12月如患者未獲得活產(chǎn)但仍有剩余的未移植的冷凍胚胎，則不納入統(tǒng)計，多次活產(chǎn)僅納入首次活產(chǎn)周期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對于正態(tài)或非正態(tài)分布資料分別采用兩獨(dú)立樣本t檢驗或Mann-Whitney′sU檢驗，計數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率計算法。結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素回歸分析，校正混雜因素，分析影響結(jié)局的相關(guān)因素。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者新鮮周期的基礎(chǔ)參數(shù)情況各組間取卵年齡、不孕年限、身高、體質(zhì)量指數(shù)、AMH、bFSH、bLH、原發(fā)不孕比例以及不孕因素分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 患者新鮮周期的基礎(chǔ)參數(shù)情況Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

表1 患者新鮮周期的基礎(chǔ)參數(shù)情況Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

指標(biāo)例數(shù)取卵年齡［例（%）］≤25 歲26～30 歲31～35 歲不孕年限（年）身高（cm）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）抗繆勒氏激素（ng/mL）bFSH（U/L）bLH（U/L）原發(fā)不孕［例（%）］不孕因素［例（%）］輸卵管盆腔因素排卵障礙子宮內(nèi)膜異位癥男性因素雙方因素組1（＜0.5 ng/mL）801 29.31±2.97 90（11.24）425（53.06）286（35.71）3.97±2.31 158.62±4.41 21.40±3.14 7.82±4.62 4.97±1.25 4.86±3.98 471（58.80）393（49.06）82（10.24）16（2.00）123（15.36）187（23.35）組2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 29.48±3.02 154（9.47）854（52.52）618（38.01）3.99±2.37 158.40±4.56 21.33±3.04 7.54±4.45 5.07±1.28 4.57±2.87 921（56.64）783（48.15）143（8.79）22（1.35）263（16.17）415（25.52）組3（1.15 ～1.49 ng/mL）499 29.74±2.89 42（8.42）245（49.10）212（42.48）3.86±2.38 158.14±4.62 21.47±3.05 7.19±4.40 5.08±1.48 4.48±3.09 274（54.91）228（45.69）49（9.82）11（2.20）83（16.63）128（25.65）組4（≥1.5 ng/mL）997 29.52±2.71 82（8.22）518（51.96）397（39.82）3.93±2.32 158.20±4.95 21.27±3.01 6.93±5.25 5.11±1.35 4.47±3.03 569（57.07）488（48.95）73（7.32）24（2.41）172（17.25）240（24.07）P 值0.087 0.118 0.687 0.158 0.632 0.075 0.174 0.138 0.565 0.409

2.2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發(fā)育情況組1 與組2（對照組）相比，Gn 啟動量、hCG 日E2 水平、獲卵數(shù)和冷凍胚胎數(shù)均顯著下降，優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率顯著增加（均P＜0.01）。組3 與組2（對照組）相比，Gn 總量顯著增加（P＜0.05）。組4與組2（對照組）相比，Gn 啟動量、Gn 總天數(shù)和Gn總量均顯著增加，優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率顯著下降（均P＜0.01）。新鮮周期全胚冷凍原因在各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），組1、組2和組3 冷凍主要原因為預(yù)防卵巢過度刺激綜合征（OHSS），組4 冷凍主要原因為生化指標(biāo)異常（如E2 升高，P4 升高等），其次為預(yù)防OHSS。見表2。

表2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發(fā)育情況Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

表2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發(fā)育情況Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

注：Gn 為促性腺激素；HCG 為絨毛膜促性腺激素；E2 為雌二醇；OHSS 為卵巢過度刺激綜合征；ICSI 為卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射；IVF為體外受精；與組2 對比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

指標(biāo)例數(shù)促排方案［例（%）］激動劑方案拮抗劑方案Gn 啟動量（IU）Gn 總天數(shù)Gn 總量（IU）HCG 日E2（pmol/L）新鮮周期全胚冷凍原因［例（%）］預(yù)防OHSS盆腔或?qū)m腔因素血清生化指標(biāo)異常個人因素其他因素授精方式［例（%）］ICSI IVF獲卵數(shù)優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)優(yōu)質(zhì)胚胎率［例（%）］冷凍胚胎數(shù)冷凍胚胎率［例（%）］組1（＜0.5 ng/mL）801 610（76.15）191（23.85）147.09±42.06*11.99±2.60 1 865.88±757.48 15 294.70±4 261.56***668（83.40）89（11.11）4（0.50）10（1.25）30（3.75）146（18.23）655（81.77）17.65±7.12***3.73±3.09 2 984（35.41）**8.35±5.09 **6 691（62.26）***組2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 1 226（75.40）400（24.60）152.15±40.42 11.93±2.37 1 937.35±721.27 16 788.22±2 884.48 1 409（86.65）130（8.00）36（2.21）18（1.11）33（2.03）307（18.88）1 319（81.12）20.06±7.19 3.93±3.30 6 396（33.34）9.16±5.18 14 893（60.61）組3（1.15～1.49 ng/mL）499 379（75.95）120（24.05）157.00±39.69 12.09±2.22 2 051.86±776.92*16 754.91±2 908.95 400（80.16）28（5.61）62（12.42）3（0.60）6（1.20）84（16.83）415（83.17）20.44±7.74 3.91±3.41 1 951（31.73）9.44±5.49 4 709（59.28）組4（≥1.5 ng/mL）997 735（73.72）262（26.28）167.07±45.55***12.49±2.36***2 299.96±925.12***16 487.30±3 167.09 178（17.85）16（1.60）797（79.94）4（0.40）2（0.20）191（19.16）806（80.84）20.70±9.30 3.71±3.42 3 696（31.43）**8.82±5.74 8 798（58.42）***P 值0.627＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.708＜0.001 0.254＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 全凍策略后首次FET 周期情況及累積活產(chǎn)率與對照組相比，組1、組3 和組4 中首次FET 的胚胎數(shù)、時間、移植優(yōu)質(zhì)胚胎周期比例、內(nèi)膜厚度和自然周期比例以及首次移植活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組4 累積活產(chǎn)率顯著低于對照組（69.71%vs. 75.83%，P＜0.01），組1、組3 累積活產(chǎn)率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組4 各年齡段累積活產(chǎn)率最低，組2 最高，年齡分層后的累積活產(chǎn)率見圖1。全凍策略后首次FET周期情況及累積活產(chǎn)率見表3。

表3 全凍策略后首次FET 周期情況及累積活產(chǎn)率Tab.3 First FET cycle and cumulative live rate after freeze-all strategy例（%）

圖1 年齡分層后的P4 各組累積活產(chǎn)率Fig.1 Cumulative live birth rate in different P4 groups after age stratification

2.4 多因素回歸分析P4對全凍周期累積活產(chǎn)率的影響校正年齡、不孕年限、可利用胚胎數(shù)、授精方式后發(fā)現(xiàn)，取卵周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL仍顯著降低累積活產(chǎn)率（OR= 0.759，95%CI：0.63～0.91，P＜0.01），P4 ＜0.5 ng/mL 不會影響全凍周期累積活產(chǎn)率（P＞0.05）。

3 討論

P4 ≥1.5 ng/mL 是目前廣泛使用的孕酮升高的閾值［3］，目前孕酮升高會通過降低子宮內(nèi)膜容受性而對植入產(chǎn)生不利影響已達(dá)成共識［2，14-15］，因此全胚冷凍可以部分緩解這一問題。另有研究提出，提前升高的孕酮水平不僅對種植窗子宮內(nèi)膜存在影響，對胚胎的發(fā)育也有負(fù)面效應(yīng)［5-6］，認(rèn)為孕酮增加與優(yōu)質(zhì)囊胚率降低有關(guān)［16］。本研究中也得到了相似的結(jié)果，P4 ≥1.5 ng/mL 組在年齡、獲卵數(shù)與對照組相似的情況下，盡管優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)與冷凍胚胎數(shù)無明顯差異，但是優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率顯著下降。迄今為止，大多數(shù)研究者僅探討新鮮周期hCG 日高孕酮水平對新鮮移植周期的影響［10］，以及在第一次冷凍胚胎移植的妊娠率，而不是累積妊娠率［17］。只有少數(shù)研究探討了其對累積活產(chǎn)率的潛在影響［7-9］，且有研究納入了包含新鮮移植周期的累積活產(chǎn)率［7-8］，而目前已經(jīng)明確高孕酮對新鮮移植周期結(jié)局的負(fù)面影響，從而影響了累積活產(chǎn)率的準(zhǔn)確性。本研究評估了新鮮周期hCG 日各孕酮水平對年輕患者全凍周期累積活產(chǎn)的影響，從而提高了結(jié)果的臨床適用性。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)新鮮周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL，解凍周期首次活產(chǎn)率無差異，累積活產(chǎn)率降低，接著對取卵年齡等因素進(jìn)行了校正后，P4 ≥1.5 ng/mL 對累積活產(chǎn)率仍產(chǎn)生影響，這也間接說明高孕酮對胚胎質(zhì)量（而不僅僅是形態(tài)學(xué)質(zhì)量）產(chǎn)生了影響，從而降低了累積活產(chǎn)率，雖然高孕酮影響胚胎質(zhì)量的機(jī)制尚不清楚。

P4 1.0 ～1.49 ng/mL 組與對照組相比，和≥1.5 ng/mL 組一樣，在獲卵數(shù)與對照組相似的情況下，優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在未校正或校正其他因素后，全胚冷凍首次移植累積活產(chǎn)率差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。說明在這個范圍內(nèi)的孕酮對胚胎質(zhì)量并沒有影響，也不會影響累積活產(chǎn)率。

與對照組相比，低孕酮組（P4 ＜0.5 ng/mL）患者取卵年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義，獲卵數(shù)較少，導(dǎo)致冷凍胚胎數(shù)較少，但是優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率顯著增加，說明低孕酮并不會影響胚胎質(zhì)量。之前的研究認(rèn)為hCG 日低P4 水平與黃體生成減少和/或子宮內(nèi)膜容受性改變有關(guān)［10］，從而導(dǎo)致新鮮移植周期活產(chǎn)率降低［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮周期的低P4 水平并不會影響全凍周期的首次移植活產(chǎn)率和累積活產(chǎn)率，說明低P4 水平并不會影響胚胎質(zhì)量。

本研究局限性主要為：（1）為避免其他潛在的混雜因素，本研究研究對象僅包括取卵年齡在≤35 歲、第1 次IVF 周期、拮抗劑方案或者激動劑方案的患者。（2）有研究認(rèn)為P4 對高反應(yīng)的患者移植結(jié)局影響更明顯［11］，但是本研究并沒有對不同卵巢反應(yīng)的患者進(jìn)行分析。（3）由于只納入了年齡≤35 歲的患者，所以本研究結(jié)果是否適用于高齡患者還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL 顯著降低年輕患者全胚冷凍后的累積活產(chǎn)率，可能與高孕酮水平影響優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍胚胎率有關(guān)，孕酮水平＜0.5 ng/mL 不會影響胚胎質(zhì)量，也不會影響全胚冷凍周期的累積活產(chǎn)率。