不同分子質量絲素蛋白的分離與表征

丁夢瑤, 戴夢男, 李 蒙， 劉 蘋, 徐晶晶, 王建南,2

(1. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學 現代絲綢國家工程實驗室， 江蘇 蘇州 215123)

蠶絲(家蠶絲)主要由絲素蛋白和絲膠蛋白構成，其中絲素蛋白占70%～80%，由重鏈(H鏈)、輕鏈(L鏈)和糖蛋白(P25鏈)組成，物質的量比為6∶6∶1，分子質量分別為390、25和30 ku[1]。絲素蛋白具有無可比擬的皮膚親和性，采用混紡、表面接枝絲素蛋白或絲素蛋白后整理可改善合成纖維的舒適性和染色性等。此外，絲素蛋白在用于細胞外基質、組織工程支架、藥物載體等生物醫用材料領域已取得了突破性的研究。

無論用于對傳統紡織品性能的改良還是醫用材料的研究，絲素蛋白分子質量的大小及其分散程度是影響絲素蛋白性能的主要因素，許多學者嘗試通過調節絲素蛋白的分子質量來調控其結構與性能。再生絲素蛋白制備過程中，溶解家蠶絲素蛋白纖維的溶劑通常用含有氯化鈣的三元溶液[2-3]和溴化鋰溶液[4-5]。現有研究指出，調控溶解條件可有效地改變絲素蛋白溶液的分子質量分布[6]。如脫膠的絲素蛋白纖維在50 ℃三元溶液中溶解24 h，得到的絲素蛋白分子質量分布在17～63 ku之間，平均分子質量約為42 ku[7]，這種低分子質量的絲素蛋白粉末能顯著激活凝血級聯反應的內在途徑，促進止血。絲素蛋白纖維在85 ℃的三元溶液中，通過溶解不同時間可以制備出分子質量在16～450 ku范圍的絲素蛋白[8]。當采用溴化鋰溶液溶解時，在90 ℃溶解6 h獲得的絲素蛋白分子質量分布在25～120 ku之間，在60 ℃溶解1 h的絲素蛋白分子質量分布在20～250 ku之間[9]，并且較低分子質量和分子質量分布窄的絲素蛋白制備的微球形貌更好、表面更光滑。使用不同截留分子質量的透析袋也可有效調控分子質量分布的范圍，當使用截留分子質量為100 ku的透析袋透析絲素蛋白溶液時，可得到分子質量高于80 ku的絲素蛋白，這種絲素蛋白具有較高的疏水性和較低的表面張力[10]。

另外有研究指出，通過不同的脫膠工藝(改變脫膠劑種類、濃度、脫膠時間等)也可改變再生絲素蛋白的分子質量[11-13]。無論是改變脫膠工藝還是調控溶解參數，獲得的絲素蛋白仍是分子質量連續分布的高分散性混合物，雖然透析袋規格可控制分子質量的范圍，但透析袋規格有限，難以獲得各級別分子質量且分散系數較小的絲素蛋白。凝膠層析是利用被分離物質分子大小不同及固定相具有分子篩的特點，將被分離物質按分子大小分開，達到分離的目的[14]，但極少用于絲素蛋白的分離[15]，也沒有對分離條件進行探索的報道。本文使用葡聚糖凝膠G-15對溶解的絲素蛋白脫鹽后，進一步使用分離范圍為5～800 ku的葡聚糖凝膠 G-200對不同分子質量的絲素蛋白進行分離，探索層析柱層流面積、絲素蛋白質量濃度及流速等因素對分離效果的影響，進一步對不同分子質量范圍的絲素蛋白進行組成和結構分析。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：桑蠶生絲，如皋市春秋絲綢有限公司；碳酸鈉、尿素、β-巰基乙醇、溴酚藍和過硫酸銨，國藥集團化學試劑有限公司；溴化鋰(LiBr)，合肥精匯化工研究所；葡聚糖G-15、葡聚糖G-200、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R-250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；氨基丁三醇(Tris)，Promega公司；冰醋酸、異丙醇、乙醇、丙三醇、鹽酸(HCI)等，均為分析純，由蘇州大學材料中心提供。

儀器：MP-2000定量送液泵，日本Eyela東京理化器械株式會社；Christ ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；Mini Protean Tetra小型垂直蛋白電泳系統，美國Bio-Rad公司；AR-2000旋轉流變儀，美國TA Instruments公司；L-8800高速氨基酸分析儀，日本Hitachi有限公司；J-815圓二色光譜儀，日本Jasco公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀，英國Malvern儀器有限公司；層析柱，上海之信有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

將桑蠶生絲以浴比為1∶50置于質量分數為0.06%的Na2CO3水溶液中沸煮40 min，然后在去離子水中徹底沖洗；重復2次后再沸煮30 min，徹底沖洗后置于60 ℃烘箱中干燥，得到脫膠絲素蛋白纖維。取脫膠絲素蛋白纖維以浴比為3∶20溶于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，在(65±2) ℃攪拌溶解1 h，得到絲素蛋白溶液。

1.2.2 凝膠層析脫鹽

取10.5 mg葡聚糖G-15放入50 mL滅菌去離子水中，于100 ℃水浴2 h使其充分吸水膨脹，待冷卻至常溫后注入層析柱(脫鹽柱)，在重力作用下充分沉降；再用5倍柱體積的滅菌去離子水平衡脫鹽柱3次，加入絲素蛋白溶解液，使用蠕動泵調節流速并持續補充滅菌去離子水，收集絲素蛋白水溶液，旋轉蒸發濃縮到質量濃度為80～100 mg/mL；最后，將脫鹽柱用5倍柱體積的滅菌去離子水洗滌平衡，再次用于絲素蛋白溶液脫鹽分離或密封后于4 ℃保存。

1.2.3 凝膠層析分離

葡聚糖G-200凝膠層析柱的制備與上述脫鹽層析柱G-15相同，在加入足量的滅菌去離子水洗脫平衡后，將上述葡聚糖G-15脫鹽后收集的絲素蛋白水溶液通過分離柱分離。調節流層面積(層析柱內徑10、26、35 mm)、絲素蛋白質量濃度(10、20、30 mg/mL)和層流流速(15、30、60 mL/h)，用離心管依次收集分離的絲素蛋白(1 mL/管)水溶液，依次編號為1#～21#。

1.3 測試方法

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳測試

SDS-PAGE電泳測試按照文獻[16]所述方法采用小型垂直蛋白電泳系統進行。按表1配方制備10%分離膠和5%濃縮膠。調節各管編號后的絲素蛋白水溶液質量濃度為5 mg/mL，取20 μL絲素蛋白水溶液與適量的含溴酚藍標記物的蛋白上樣緩沖液共混后沸水加熱5 min，在13 000 r/min條件下離心10 min；用微量進樣器取15 μL離心后的絲素蛋白溶液加入到5%濃縮膠的孔中，設置電壓為60 V運行30 min，然后在120 V下運行至溴酚藍指示劑抵達分離膠的下邊緣；取出凝膠，采用考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h，然后加入脫色液振蕩直至脫除背景色。根據凝膠電泳的結果，對不同分子質量特征的絲素蛋白進行分組。各組保留一部分絲素蛋白新鮮水溶液用于黏度、Zeta電位與圓二色光譜測試;一部分絲素蛋白水溶液置于-80 ℃冷凍2 h，然后冷凍干燥24 h，取出密封保存于4 ℃，用于氨基酸組成測定。

表1 10%分離膠與5%濃縮膠的配方Tab.1 Formula of 10% resolving gel and 5% stacking gel

1.3.2 Zeta電位測試

調節各組絲素蛋白水溶液質量濃度為0.5 mg/mL，使用納米粒度電位儀測定不同pH值(1～7和7.4)下的Zeta電位，用于表征絲素蛋白表面的電荷性質。每個樣品測試3次，取平均值。

1.3.3 黏度測試

調節各組絲素蛋白水溶液質量濃度為5 mg/mL，使用旋轉流變儀測定絲素蛋白的黏度，獲得剪切速率-黏度曲線。參數設置：Flow Ramp模式，采用直徑為40 mm的1.0°鋼制錐板，測試溫度為25 ℃，剪切速率范圍為0～100 s-1。

1.3.4 氨基酸測試

取凍干的絲素蛋白各100 mg置于18 mL鹽酸中，充氮氣以排除空氣，110 ℃水解24 h后定容至50 mL。取定容后溶液1 mL于65 ℃烘干，再用20 mL的0.02 mol/L鹽酸溶解和0.22 μm膜過濾，然后使用高速氨基酸分析儀測定氨基酸組成。

1.3.5 圓二色光譜測試

調節絲素蛋白水溶液質量濃度為0.02 mg/mL，采用超聲波并設定300、500 W的功率分別處理45 s，或在37 ℃下振蕩孵育8 h。使用圓二色光譜儀測試絲素蛋白的二級結構，以未經超聲波處理的各組絲素蛋白新鮮水溶液作為對照。參數設置為：光徑為0.5 mm的石英樣品池，帶寬1.0 nm，掃描速率100 nm/min，響應時間1.0 s，掃描波長范圍190～250 nm。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE電泳測試結果分析

經葡聚糖凝膠對絲素蛋白分離的初步探索發現，葡聚糖凝膠G-200對絲素蛋白的分離有比較明顯的效果，進一步研究了絲素蛋白質量濃度、層流速度和層流面積對分離效果的影響發現，控制層流速度對分離效果有顯著的影響。圖1示出用葡聚糖凝膠G-200以不同流速分離絲素蛋白的電泳結果。未分離的絲素蛋白電泳圖上顯示其在整個泳道呈高分散性的分布(見圖1(a))。以15 mL/h的流速收集的21管絲素蛋白分子質量均出現大范圍的連續分布，除最初的3管樣品分子質量分布于20 ku以上，其余各泳道條帶分布沒有明顯區別，均連續分布至15 ku及以下(見圖1(b))。以60 mL/h的流速收集的21管絲素蛋白分子質量也沒有明顯分離出來(見圖1(d))。以30 mL/h的流速收集的21管絲素蛋白呈現明顯的分離效果(見圖1(c))：1～3泳道的分子質量主要分布在100～150 ku之間，除了2、3泳道有隱約的25 ku的條帶外，分子質量均在40 ku以上；第4泳道開始明顯出現25 ku的條帶及少量更小的蛋白；7～11泳道分子質量均勻分布于50～100 ku，但20 ku以下小分子質量的蛋白也有增多；12～18泳道中大分子質量的絲素蛋白減少，較均勻地分布在整個泳道；17泳道開始15 ku上下的相對較小分子質量的絲素蛋白明顯增加；19～21泳道主要分布的是20 ku以下的絲素蛋白。

分離結果顯示，控制流速為30 mL/h可達到明顯分離出不同分子質量范圍絲素蛋白的效果。另外，SDS-PAGE凝膠電泳分析發現，調控流層面積和絲素蛋白質量濃度對絲素蛋白分子質量的分離沒有明顯影響，本文后續使用內徑為10 mm，高為50 cm的層析柱對絲素蛋白進行分離。根據SDS-PAGE凝膠電泳分布，將分離后的絲素蛋白根據前面所分析的不同分子質量特征分為4組：1～3管收集合并標記為SF1，7～10管合并標記為SF2，13～15管合并標記為SF3，19～21管合并標記為SF4，僅脫鹽未分離的絲素蛋白標記為SF0。

圖1 不同流速分離的絲素蛋白電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of silk fibroin seperated at different laminar flow rate. (a) Unseparated silk fibroin; (b) Laminar flow rate is 15 mL/h; (c) Laminar flow rate is 30 mL/h; (d) Laminar flow rate is 60 mL/h

2.2 黏度分析

圖2示出分離出來的絲素蛋白水溶液在剪切作用下的流變行為。可以看出，所有樣品的變化規律相同，在較低的剪切速率下絲素蛋白溶液的黏度急劇增大，尤其是分子質量最大的SF1絲素蛋白，因絲素蛋白分子鏈的運動而相互糾纏，分子鏈越長，相互纏繞的概率越大。隨著剪切速率的持續增大，各組絲素蛋白均呈現剪切變稀行為，絲素蛋白分子鏈之間的纏結會被逐漸打開，分子沿剪切作用力旋轉方向排列，使黏度值逐漸下降。一般情況下，高分子溶液的黏度與其分子質量成正相關關系[17]，也與分子質量的分散系數有關。

圖2 絲素蛋白的剪切速率-黏度曲線Fig.2 Shear rate-viscosity curves of silk fibroin

表2示出不同剪切速率下的黏度值。比較相同剪切速率下樣品的黏度值大小可以發現，SF1的黏度最大，SF0次之，SF4最小。這是因為SF1的分子質量最大；SF0是未經分離的絲素蛋白，存在大量的大分子質量絲素蛋白，但其分散程度很大，也含有較多小分子質量的絲素蛋白；而SF4的分子質量最小。這一結果也證明了本文研究中使用的層析柱法可有效分離不同分子質量的絲素蛋白。

表2 不同剪切速率下的黏度值Tab.2 Viscosity of silk fibroin at different shear rates Pa·s

2.3 Zeta電位和等電點分析

絲素蛋白是天然的高分子蛋白質，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸等20種氨基酸組成，在絲素肽鏈的氨基酸殘基中，帶有—COOH的氨基酸殘基數目大于帶有—NH2的氨基酸殘基數目，這使絲素蛋白分子表面帶負電荷。絲素L鏈和P25鏈上分布的酸性氨基酸和堿性氨基酸殘基均較多，但酸堿2種氨基酸殘基數目幾乎相同(見表3中實驗測試得到的各樣品的氨基酸組成)，因此，絲素蛋白電負性來自于主要組成部分的H鏈。絲素H鏈由高度重復的氨基酸殘基(GlyAlaGlyAlaGlySer為主)的鏈段與高度保守的非重復氨基酸殘基的鏈段有規律交替排列，其中非重復區鏈段含有3個酸性氨基酸殘基和1個堿性氨基酸殘基。

表3 絲素蛋白組成中各氨基酸理論摩爾分數與實測摩爾分數Tab.3 Mole percentage of each amino acid in silk fibroin %

圖3示出不同pH值下各組絲素蛋白溶液的Zeta電位的變化。可以看出，5組絲素蛋白的等電點由大到小依次為SF1、SF0、SF2、SF3、SF4，SF0、SF1和SF2的等電點均在3.5～3.75之間。有趣的是，SF1的等電點大于對照組SF0，而SF2的等電點略小于SF0。SF3和SF4的等電點顯著小于前3組樣品，分別為1.75～2.0和1.5～1.75之間。

圖3 絲素蛋白的電負性Fig.3 Electronegativity of silk fibroin

圖4示出pH值為7.4的環境下4組分離的絲素蛋白樣品的Zeta電位值與未分離SF0樣品的比值。結果同樣顯示，SF1的電負性略小于對照組SF0。從SDS-PAGE電泳圖可見，SF1的分子質量較大，這說明分離掉的小分子絲素蛋白含有的酸性 氨基酸殘基占比較多。相比于對照組SF0，SF2～SF4的電負性顯著增加，尤其是SF4，進一步說明小分子絲素蛋白SF4中含有的酸性氨基酸殘基與堿性氨基酸殘基數目的差值更大。綜合電位值與等電點測定結果可知，隨著層析柱分離的進行，絲素蛋白中—COOH含量多于—NH2含量的鏈段的相對比例是逐漸增多的。

圖4 分離的各組絲素蛋白與未分離 絲素蛋白的表面電位比值Fig.4 Surface potential ratios of separated and unseparated silk fibroin

2.4 氨基酸組成分析

基于Zeta電位值出現的有趣現象，進一步對各組絲素蛋白的氨基酸組成進行分析。根據絲素蛋白H鏈、L鏈和P25鏈的氨基酸組成[18-20]，可以計算出絲素蛋白分子中所有氨基酸的理論摩爾分數，如表3所示。可以看出，SF0及分離的各組樣品SF1～SF4的氨基酸組成中，含量最多的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸。SF0～SF4的甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸之和分別占總氨基酸組成的85.53%、85.46%、85.32%、85.37%和85.91%，這3種氨基酸在H鏈中的摩爾分數均顯著高于L鏈和P25鏈，SF1中H鏈的含量略高于SF2和SF3，說明SF1中主要是分子質量大的H鏈的鏈段，數據變化不大是由于H鏈的分子質量遠遠大于L鏈和P25鏈，且1個絲素分子中有6條H鏈、6條L鏈和1條P25鏈。纈氨酸是化學性質穩定的氨基酸。表3顯示H鏈中纈氨酸含量顯著小于L鏈和P25鏈，分離后的4組SF樣品中，纈氨酸的摩爾分數增加，尤其是SF3樣品。由結果可以推測,隨著分離的進行，后續分離的絲素蛋白中除了小分子質量的H鏈仍然占主要組分外，分子質量小的L鏈和P25鏈的比例逐漸增多，尤其是SF3蛋白組。

由于色氨酸經鹽酸處理后被破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺分別轉化為天冬氨酸和谷氨酸，所以表3中色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺實測值為0。從谷氨酸(包含谷氨酰胺)和纈氨酸結果可以推測，SF3樣品中含有的L鏈多于P25鏈；而從半胱氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸的結果推測，SF4樣品中含有的P25鏈可能多于L鏈。總之，L鏈和P25鏈主要分布在SF3和SF4樣品中。

從表3中SF分子組成的3種肽鏈可知，L鏈中的酸性氨基酸和堿性氨基酸數量相近，而P25鏈中的堿性氨基酸數目多于酸性氨基酸，這似乎無法解釋SF樣品的電負性隨著分離的進行而增大的現象，為此進一步觀察SDS-PAGE電泳圖可以發現，SF4樣品中稍大于15 ku附近出現了較深較寬的條帶，結合甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸3種氨基酸含量可以推測，這部分蛋白含有較多的H鏈被切斷形成的小分子鏈段，同時也是富含非重復區的鏈段，此鏈段中酸性氨基酸數目多于堿性氨基酸，所以隨著分離的進行，SF樣品的電負性顯著提高。相比于SF0和SF1樣品，SF2也出現了電負性的顯著增加，也是因為15 ku附近出現了較深較寬的條帶，即H鏈非重復區鏈段的增加(見圖1(c)7～10泳道)。

進一步分析各組樣品中親水性氨基酸的分布與含量,結果如圖5所示。可知，SF3含有的親水性氨基酸略高些，但所有組間沒有顯著的差異。雖然后面分離出來的P25鏈和L鏈含有更多的酸堿性氨基酸，但H鏈的小鏈段中含有更多親水性的絲氨酸。

圖5 絲素蛋白樣品中親水性氨基酸含量Fig.5 Hydrophilic amino acid content in silk fibroin sample

2.5 圓二色光譜分析

遠紫外光區的圓二色光譜分析常用于蛋白質或多肽的二級結構研究，提供α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等分子構象的信息[21-22]。195～197(+) nm處的正科頓效應和217～218(-) nm處的負科頓效應歸屬于β-折疊結構；191(+) nm處的正科頓效應以及207～210(-)和221～222(-) nm處的負科頓效應歸屬于α-螺旋結構；193(-) nm附近、200～205(+)和227(-) nm處的特征峰歸屬于β-轉角結構；無規卷曲的特征峰位于195～202(-)、215～218(+)和230(-) nm附近[22]。

分離的新鮮水溶液中的絲素蛋白分子沒有經過外界因素的作用，分子運動較弱，主要是分子鏈的伸展和分子鏈之間較弱的次級鍵相互作用。圖6示出未經處理的新鮮絲素蛋白SF0～SF4溶液的圓二色光譜。可以看出：在199～203 nm處均出現了強的歸屬于無規卷曲的負科頓效應，SF1和SF4的無規卷曲特征峰較弱；SF0和SF4(強度較弱)的圓二色光譜在195 nm附近出現了β-折疊結構的正科頓效應，SF1的圓二色光譜在215 nm附近出現了α-螺旋與β-折疊結構互變的負科頓效應。超聲波處理可加速分子鏈的運動及分子間的碰撞，使絲素蛋白自組裝形成穩定的分子構象。高強度超聲波處理后(圖6中每組絲素蛋白的樣品D)，所有樣品均呈現相似的圓二色曲線，在195～198(+) nm處出現很強的β-折疊結構特征峰；除SF2在215～217(-) nm處出現了較強的β-折疊結構特征峰，SF0～SF3這4種絲素蛋白在222～223(-) nm附近出現了較強的α-螺旋特征峰，SF4的特征峰偏移至224(-) nm附近，屬于α-螺旋與β-轉角結構互變的負科頓效應。低強度超聲波處理后樣品的圓二色光譜曲線與高強度處理的相似(圖6中每組絲素蛋白的樣品C)，僅有分子質量最小的SF4在224(-) nm處的特征峰進一步偏移至225(-) nm附近，說明存在更多的β-轉角結構，這是因為部分分子鏈較短的H鏈非重復區鏈段不能形成穩定的α-螺旋，在氫鍵的作用下形成了β-轉角結構。

注：[θ]代表摩爾橢圓度；A為新鮮溶液；B為37 ℃孵育8 h的溶液；C為300 W超聲波處理的溶液；D為500 W超聲波處理的溶液。 圖6 絲素蛋白樣品溶液的CD光譜圖Fig.6 CD spectra of silk fibroin

去除外力機械作用，在溫和的37 ℃下靜置(圖6中每組絲素蛋白的樣品B)，絲素蛋白分子構象也發生著動態的轉變，放置8 h后，SF1～SF4的絲素蛋白在216～218(-)nm處出現了中等強度的β-折疊結構特征峰，SF0在此處的特征峰較弱,所有樣品均出現β-轉角結構的特征峰；隨著分子質量的減少，無規卷曲結構的含量逐漸增多。

3 結 論

絲素蛋白纖維溶解后形成了各種分子質量連續分布且分散性大的絲素蛋白溶液，本文通過凝膠層析法中葡聚糖G200的分子篩效應對不同分子質量的絲素蛋白進行了有效分離。最先收集的分子質量分布在100～150 ku之間的絲素蛋白溶液黏度最大，大于未分離的絲素蛋白。隨著分離的進行，絲素蛋白溶液的黏度顯著下降，電負性增加，分析可知H鏈非重復區鏈段的比例隨之增大，導致無規卷曲結構的含量有所增加，證明了分子質量的變化和分離的有效性。

分離獲得的不同分子質量特征或氨基酸組成不同的絲素蛋白，兩性性質和結構有很大的差異，其后續應用(如對滌綸織物的優化改性)還需全面和深入研究。