楊木酶水解液培養枯草芽孢桿菌試驗

游佳欣，應文俊，楊倩倩，廖紅，徐勇，張軍華,2*

(1. 南京林業大學化學工程學院,南京 210037； 2. 西北農林科技大學林學院,陜西 楊凌 712100)

楊樹是我國三大速生人工林樹種之一，常用于制漿造紙、家具、建材等。在楊木加工過程中，會產生約40%的楊木廢渣，將其制備成生物乙醇[1-2]或高值化學品[3]符合我國綠色經濟的理念。益生菌是指對宿主的生理功能產生有益作用的活性微生物，常用于食品、醫藥和畜牧領域[4-5]。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，具有生長速度快、營養需求簡單、無毒無害、抗逆性強等優點，其作為國家允許使用的飼料添加劑，在畜牧養殖業中被廣泛應用。枯草芽孢桿菌能夠分泌纖維素酶、蛋白酶等多種酶、抗菌素等活性物質，提高飼料轉化率，促進消化，增強動物免疫力。如在生長肥育豬日糧添加0.03%(質量分數)的枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌，可提高肥育豬的采食量和消化率[6]。

筆者以楊木酶水解液為原料，采用單因素試驗和響應面試驗優化了枯草芽孢桿菌的培養基組成和培養條件，繪制了楊木酶水解液培養枯草芽孢桿菌的生長曲線，探討了枯草芽孢桿菌代謝不同單糖的規律和菌體生長的規律。本研究以楊木纖維素酶水解液作為碳源發酵制備益生菌，為楊木廢棄物的高值化利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 楊木酶水解液

楊木酶水解液由南京林業大學生物工程系生物化工研究所制得。以楊木屑為原料，經乙酸預處理制備低聚木糖后，利用過氧化氫-乙酸預處理脫除木質素，再經纖維素酶水解得到。楊木酶水解液的化學組成為101.7 g/L葡萄糖、20.7 g/L木糖、8.6 g/L纖維二糖、3.6 g/L乙酸、0.7 g/L乙酰丙酸和0.4 g/L的5-羥甲基糠醛。

1.1.2 枯草芽孢桿菌

BacillussubtilisYS01，由南京林業大學生物工程系生物化工研究所保藏。

1.1.3 纖維素酶

纖維素酶CTec2購自諾維信(中國)生物技術有限公司，酶活為123 FPU/mL，酶蛋白含量為176.2 mg/mL。

1.1.4 主要設備

MAXQ4000型恒溫搖床(美國賽默飛)、MLS-3020型高壓滅菌鍋(日本三洋)、1.6R型冷凍離心機(美國賽默飛)、MSC1.2型無菌操作臺(美國賽默飛)、752S型紫外可見光分光光度計(上海棱光技術有限公司)、FE20型pH計(瑞士梅特勒-托利多)、PL303型電子天平(瑞士梅特勒-托利多)、Agi-lent 1260型高效液相色譜儀(德國安捷倫)。

1.1.5 培養基

枯草芽孢桿菌活化培養基：1.0%(質量分數)葡萄糖，1.0%(質量分數)魚粉蛋白胨，0.5%(質量分數)酵母膏，1.0%(質量分數)NaCl，pH為7.0。

瓊脂固體培養基(用于平板計數法計算枯草芽孢桿菌活菌數)：0.50%(質量分數)魚粉蛋白胨，0.25%(質量分數)酵母膏，0.10%(質量分數)葡萄糖，1.50%(質量分數)瓊脂，pH為7.0。

初始發酵培養基：1.00%(體積分數)楊木酶水解液，1.00%(質量分數)魚粉蛋白胨，0.15%(質量分數)K2HPO4，0.02%(質量分數)MgSO4，pH為7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 技術路線

楊木屑經乙酸預處理[6.5%(體積分數)乙酸，172 ℃，27 min] 制備低聚木糖后，水洗至中性，自然風干后，得到固體殘渣。以此固形物為原料，采用75%(體積分數)的過氧化氫-乙酸(體積比為1∶1)預處理(80 ℃，2 h)[7]，將預處理殘渣進一步酶水解后得到楊木酶水解液，酶水解液中含有豐富的單糖(葡萄糖和木糖)，將作為后續發酵生產枯草芽孢桿菌的碳源。

1.2.2 種子液的制備

吸取保藏于-18 ℃的甘油管中的菌液100 μL，接種于活化培養基中，于37 ℃、150 r/min條件下培養24 h后，作為種子液備用。

1.2.3 OD600值、活菌數的測定和生長曲線的繪制

OD600值、活菌數的測定和生長曲線的繪制方法參考Fan等[8]的方法。

1.2.4 糖含量的檢測

葡萄糖和木糖質量濃度的測定采用高效液相色譜法。測試樣品先經過10 000 r/min離心5 min，先稀釋相應倍數，上清液經0.22 μm的濾膜過濾后，在Agilent 1260型高效液相色譜儀上，色譜柱為Bio-Rad HPX-87H(300 mm×7.8 mm,長×內徑)，Bio-Rad MG Cartridges(30 mm×4.6 mm,長×內徑)，流動相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，在示差折光檢測器(RI)上進行檢測。

1.2.5 單因素優化培養基組分

按照初始發酵培養基組分進行單因素優化試驗，培養基中碳源固定為楊木酶水解液，分別研究氮源(硫酸銨、脲、牛肉膏、酵母浸膏、魚粉蛋白胨)、無機鹽(NaCl、KCl、Na2SO4、K2SO4、Na2HPO4、K2HPO4)、微量元素(MnSO4、MgSO4、ZnCl2、CaCl2)對枯草芽孢桿菌生長情況的影響。確定最適氮源、無機鹽和微量元素后，分別研究楊木酶水解液添加量(0%～5.00%)、氮源添加量(0%～5.00%，質量分數)、無機鹽添加量(0.010%～0.125%，質量分數)和微量元素添加量(0%～0.05%，質量分數)對枯草芽孢桿菌生長的影響。

根據試驗設計配制發酵培養基，滅菌后接種，置于37 ℃、150 r/min條件下發酵培養24 h，每組試驗設置3個平行，測定其OD600值和活菌數，分析比較后得到最佳培養基組分。

1.2.6 單因素優化培養條件

按照單因素優化的培養基組分配制發酵培養基，分別考察溫度(30，35，40，45和50 ℃)、pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)、搖床轉速(110，130，150，170，190和210 r/min)、接種量(0.5%，1.0%，2.0%，5.0%和10.0%體積分數)和裝液量(5，10，15，20和25 mL，相對于50 mL體系)對枯草芽孢桿菌生長的影響，每組試驗設置3個平行，測定其OD600值和活菌數，分析比較后得到最佳培養條件。

1.2.7 培養基組分的響應面優化

根據單因素優化后的培養基組成，選取楊木酶水解液添加量(2.00%～4.00%體積分數)、魚粉蛋白胨添加量(1.00%～3.00%質量分數)、K2HPO4添加量(0.03%～0.07%質量分數)3因素3水平，根據軟件Design-Expert 12設計的試驗方案，每組試驗設置3個平行，按照優化后的培養條件進行響應面優化培養24 h后記錄結果，并對優化出的結果進行5次重復，利用軟件Design-Expert 12進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 培養基單因素優化

2.1.1 楊木酶水解液添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響

以楊木酶水解液為碳源時，其添加量對枯草芽孢桿菌生長情況的影響如圖1a所示。當培養基中不添加酶水解液時，培養基中的活菌數僅有1.86×108CFU/mL，隨著酶水解液的添加量增加至3.00%(質量分數)，活菌數明顯增加，說明菌體生長情況最好；隨著培養基中酶水解液添加量從3.00%增加至5.00%，活菌數并沒有隨之增加，反而出現緩慢下降趨勢。因此選擇3.00%為培養基中最佳楊木酶水解液添加量。

圖1 碳源和氮源對枯草芽孢桿菌生長情況的影響

2.1.2 氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響

氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響如圖1b所示，相比添加無機氮源，有機氮源富含蛋白質等營養物質，更適合枯草芽孢桿菌的培養，魚粉蛋白胨作為氮源時，枯草芽孢桿菌生長情況最佳，因此選擇魚粉蛋白胨作為枯草芽孢桿菌培養基中的唯一氮源。此外，研究氮源添加量對枯草芽孢桿菌生長情況的影響，結果如圖1c所示。當培養基中不添加氮源時，培養基中的活菌數僅有8.23×107CFU/mL。當魚粉蛋白胨添加量由2.00%增加至5.00%，菌液中活菌數反而減少，說明魚粉蛋白胨添加過多反而不利于菌體的生長代謝。當魚粉蛋白胨添加量為2.00%時，枯草芽孢桿菌生長情況最好，活菌數可達到3.62×108CFU/mL，因此選擇2.00% 添加量為最適魚粉蛋白胨添加量。

2.1.3 無機鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響

在微生物發酵過程中，無機鹽不僅可以維持培養基pH穩定，而且提供了菌體核酸合成代謝所必需的元素[9]，是培養基重要組分之一。無機鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響如圖2a所示。分別添加Na2HPO4和K2HPO4的枯草芽孢桿菌生長情況明顯優于添加NaCl和KCl的培養基生長情況，其原因可能是Na2HPO4和K2HPO4不僅能提供枯草芽孢桿菌生長所需的Na、K元素。而且Na2HPO4和K2HPO4還能提供菌體生長所需的P元素，而且氨基酸前體的活化及一些與代謝有關的酶的合成都與P元素有關。由于添加Na2HPO4和K2HPO4對枯草芽孢桿菌生長情況影響差異不大，菌體生長情況均達到較高水平，因此僅選擇K2HPO4作為培養基無機鹽組分進行后續試驗研究。研究了K2HPO4添加量對枯草芽孢桿菌生長情況的影響，結果如圖2b所示。當K2HPO4的添加量增加到0.05%，培養24 h后活菌數最高可達3.68×108CFU/mL。因此，確定K2HPO4最優添加量為0.05%。

2.1.4 微量元素對枯草芽孢桿菌生長的影響

不同微量元素對枯草芽孢桿菌生長的影響如圖2c所示，CaCl2和MgSO4的添加均對枯草芽孢桿菌的生長有促進作用。而Mg2+在細胞中糖酵解和三羧酸循環等酶促反應中作為輔助因子，是許多酶催化反應的激活劑，選擇合適的Mg2+添加量有助于菌體生長[10]。但在培養基中添加過多的金屬離子會對細胞產生毒害作用[11]。因此，選擇MgSO4作為枯草芽孢桿菌培養基中的微量元素。MgSO4添加量對枯草芽孢桿菌的增殖效果影響不顯著，當添加量為0.04% 時，枯草芽孢桿菌生長量達到最高。因此，選擇培養基中MgSO4的添加量為0.04%。

圖2 無機鹽和微量元素對枯草芽孢桿菌生長情況的影響

經過單因素試驗優化后的培養基組成為3.00%(體積分數)楊木酶水解液、2.00%(質量分數)魚粉蛋白胨、0.05%(質量分數)K2HPO4、0.04%(質量分數)MgSO4，該培養基組成將用于后續培養條件的單因素優化試驗。

2.2 培養條件的單因素試驗

溫度主要影響菌體中酶反應速率，溫度適當升高，加快菌體中酶促反應速率，增強菌體代謝，但溫度過高將不利于菌體生長，結果如圖3a所示。隨著溫度由30 ℃升高至50 ℃，枯草芽孢桿菌活菌數先增加后降低，其中在35 ℃條件下生長情況最佳，活菌數可達到3.62×108CFU/mL。培養溫度超過35 ℃后，枯草芽孢桿菌生長能力逐漸降低。因此，選擇35 ℃為枯草芽孢桿菌最佳培養溫度。

pH對枯草芽孢桿菌生長的影響由圖3b所示，枯草芽孢桿菌在酸性和堿性環境下均具有一定耐受性[12]，當pH為4.0或9.0時，枯草芽孢桿菌仍能生長，但此種情況下并不利于其生長。根據枯草芽孢桿菌在不同pH條件下的生長情況可以看出，菌體在pH為7.0時生長情況最佳。

搖床轉速的改變對枯草芽孢桿菌生長情況的影響主要是影響通氣量，從而影響培養基中的溶氧。隨著搖床轉速增加至190 r/min，枯草芽孢桿菌生長情況達到最佳(圖3c)，活菌數可達到3.62×108CFU/mL，因此選擇最佳搖床轉速為190 r/min。

裝液量對枯草芽孢桿菌生長的影響如圖3d所示，適當調整裝液量有益于枯草芽孢桿菌的生長，50 mL三角瓶的5 mL體系中，活菌數達到最高值6.88×108CFU/mL，裝液量為10 mL時，生長情況次之，活菌數可達6.05×108CFU/mL。結合實際情況和培養效率，選擇裝液量為10 mL為最適裝液量。

圖3 培養條件對枯草芽孢桿菌生長情況的影響

接種量對枯草芽孢桿菌的增殖效果影響不顯著。當接種量為2.0%(體積分數)時，菌液中活菌數可達到最高，因此選擇的接種量為2.0%。綜上，根據培養條件的單因素優化試驗結果，確定枯草芽孢桿菌的最佳培養條件為：溫度35 ℃、pH 7.0、轉速190 r/min、接種量2.0%、裝液量為10 mL(相對于50 mL)。

2.3 響應面優化培養基組分試驗的分析

通過單因素試驗確定了影響枯草芽孢桿菌生長的3個主要因素(楊木酶水解液、魚粉蛋白胨、K2HPO4)，采用Box-Behnken的中心組合設計原理設計3因素3水平的響應面分析試驗(表1)，以最終確定最佳發酵培養基組分。對表1中結果進行分析，得到回歸模型ANOVA分析和各因素的主效應結果(圖4)，根據表1可得出模型的p值小于0.000 1，說明該模型顯著，而誤差項p值大于0.05，說明失擬項不顯著，未知因素對試驗結果干擾小。擬合檢驗顯著，說明建立的模型是有效的，與實際情況擬合較好，并且3種因素對枯草芽孢桿菌生長的影響是顯著的。

表1 響應面法對菌液OD600的ANOVA分析

兩因素交互作用影響枯草芽孢桿菌生長的響應面分析由圖4所示。其中，等高線為橢圓形，說明交互作用顯著[13-14]。等高線的疏密可以看出楊木酶水解液和魚粉蛋白胨對枯草芽孢桿菌生長的影響>楊木酶水解液和K2HPO4對枯草芽孢桿菌生長的影響>魚粉蛋白胨和K2HPO4對枯草芽孢桿菌生長的影響。軟件預測出的3種培養基組分的最優濃度為：3.20%(體積分數)楊木酶水解液、2.30%(質量分數)魚粉蛋白胨、0.06%(質量分數)K2HPO4，最優條件的預測值OD600為15.85，對應活菌數為6.34×108CFU/mL。按預測得到的最優培養基組成進行5次重復試驗，培養24 h后得到的OD600值為15.98，對應活菌數為6.39×108CFU/mL，與響應面優化試驗所得預測值接近。這表明該模型較好地預測了試驗結果，說明該模型和試驗結果是可靠的。

圖4 兩因素交互作用影響枯草芽孢桿菌生長的響應面分析

2.4 枯草芽孢桿菌生長曲線

根據響應面優化得出的最佳培養基組成以及單因素試驗優化后的最佳培養條件，分別繪制了以含相同質量濃度葡萄糖和木糖的混合單糖溶液作為對照碳源培養枯草芽孢桿菌的生長曲線(圖5a)和以楊木酶水解液作為碳源培養枯草芽孢桿菌的生長曲線(圖5b)。在0～3 h為枯草芽孢桿菌的遲緩期，3～24 h為對數生長期，24 h時枯草芽孢桿菌進入穩定期。隨著枯草芽孢桿菌進入對數生長期，培養基中的葡萄糖被枯草芽孢桿菌大量消耗用于生長繁殖，同時培養體系中的木糖含量也緩慢減少。培養24 h后，即枯草芽孢桿菌進入穩定期，此時培養基中的糖濃度都趨于0 g/L。另外楊木酶水解液中還含有纖維二糖，由圖5b可以看出枯草芽孢桿菌從第22 h開始利用纖維二糖，這說明枯草芽孢桿菌對酶水解液中糖的利用順序為葡萄糖、木糖、纖維二糖。對比圖5a與圖5b可以看出，枯草芽孢桿菌在單糖溶液配制的培養基中，消耗碳源的速度更快，生長情況也較好。并且以相同質量濃度的單糖溶液作為碳源培養枯草芽孢桿菌所得到的活菌數略高，可達到6.65×108CFU/mL，而以楊木酶水解液作為碳源時，活菌數達到6.46×108CFU/mL。對比兩種發酵培養基中發酵前后的pH可以發現，含酶水解液的培養基pH僅下降了0.84，而含單糖溶液的培養基pH發酵后下降了1.61，這是因為酶水解液中含有檸檬酸鈉，調節了培養體系中的離子平衡。

a)以單糖溶液(葡萄糖∶木糖=5∶1，質量濃度比)為碳源；b)以楊木酶水解液為碳源。

由枯草芽孢桿菌的生長曲線可以看出，枯草芽孢桿菌能較好地利用酶水解液中的葡萄糖和木糖。同時也說明枯草芽孢桿菌以楊木酶水解液為碳源時，只需添加少量氮源以及無機鹽即能生長良好。相較于傳統微生物發酵所用的葡萄糖、蔗糖等培養基組分，楊木屑不屬于糧食作物，且廉價易得，以楊木屑發酵所得的酶水解液作為碳源培養枯草芽孢桿菌，拓寬了楊木廢棄物再利用的途徑。但與已有研究進行對比，Yánez-Mendizábal等[15]利用大豆粉與糖蜜發酵枯草芽孢桿菌CPA-8，最大活菌數可達3.00×109CFU/mL，Zhang等[16]以玉米粉和黃豆粉培養芽孢桿菌Z-14，活菌數可達到1.85×109CFU/mL，活菌數略低，可能是因為楊木酶水解液成分復雜，其中所含的乙酸、乙酰丙酸等影響了枯草芽孢桿菌的生長。因此后續可通過脫毒、提高供氧等措施進一步提高菌體濃度。

3 結 論

1)以楊木酶水解液為碳源培養枯草芽孢桿菌，采用單因素試驗對培養基組成和培養條件進行了優化。最終確定，當枯草芽孢桿菌以楊木酶水解液為碳源時，最適的氮源、無機鹽、微量元素分別為魚粉蛋白胨、K2HPO4、MgSO4。最佳培養條件為溫度35 ℃、pH 7.0、轉速190 r/min、初始接種量2.0%(質量分數)、裝液量10 mL(相對于50 mL)。

2)響應面優化試驗確定了3種最重要培養基組分的最佳濃度為：3.20%(體積分數)楊木酶水解液、2.30%(質量分數)魚粉蛋白胨、0.06%(質量分數)K2HPO4。

3)在最優條件下對枯草芽孢桿菌進行培養，活菌數最終可達到6.46×108CFU/mL，比優化前的2.64×108CFU/mL有顯著提高，發酵結束后楊木水解液中的單糖消耗率可達98.7%。