晉麥47EMS突變體庫的構建及高代突變材料品質性狀的初步分析

張 婷 溫宏偉 袁 凱 逯臘虎 史曉芳 張明義 姬虎太 楊 斌

(山西農業大學小麥研究所，山西臨汾 041000)

小麥是我國主要糧食作物，提高小麥單產水平對保障我國糧食安全具有重要意義[1]。然而近年來旱地小麥育種中使用的親本來源愈漸單一，遺傳范圍逐漸狹窄，導致育成品種的遺傳相似性增加，產量、品質和對逆境的綜合抗性也少有突破性進展，增加了小麥生產的安全隱患[2]，且傳統育種周期長，自然變異率低，難以滿足人口不斷增長與可利用耕地面積不斷減少背景下對小麥育種效率的迫切需求[3]。因此，如何高效創制優異種質資源，縮短育種年限，提高育種效率，是當前小麥抗旱育種工作中亟待解決的問題。

利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)進行誘變處理是目前最為有效的化學誘變技術。其操作簡便，誘變率高，可以產生豐富的點突變，對材料損傷小，不易造成染色體畸變[4]，能夠創制出常規育種技術難以得到的新性狀[5]，被廣泛用于小麥、小稻等[6－12]種質資源創制與遺傳研究工作中。在小麥種質資源創制方面，孫玉龍等[13]通過EMS 誘變盛農1 號，對M3突變體庫生物學特性和農藝性狀進行調查，獲得了18 個穩定遺傳的變異株系；張貞彩等[14]對濟麥20 和濟麥22 EMS 誘變群體的M3種子進行理化特性分析，發現濟麥22 誘變材料直鏈淀粉平均含量低于野生型，而濟麥20 的相差不大，并篩選出2 個糊化粘度與誘變親本差異較大的材料；張紀元等[15]利用EMS創制弱筋小麥品種寧麥9 號突變體庫，獲得了Ax1、Bx7、By8、Dx2、Dx12 和Ax1＋By8 缺失的高分子量谷蛋白亞基突變體，其谷蛋白大聚體和谷蛋白/醇溶蛋白比值較對照均有不同程度降低，為弱筋小麥育種提供了新的種質材料；Yasui 等[16]誘變處理面包小麥種子，在M2材料中發現了糯質小麥突變體，最終育成了糯質普通小麥新品系K107wx1 和K107wx2。在遺傳研究方面，張維宏等[17]處理了小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19 的種子，從M3中篩選到6 個感病突變體，為Lr19 基因功能研究提供了理想的材料；Kuraparthy等[18]利用EMS 突變體將控制分蘗的tin3 基因定位在3A 染色體的長臂上；Xu 等[19]利用EMS 突變體將控制分蘗數與株高的穩定主效數量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)定位在2D 染色體的短臂上，為小麥株高和分蘗遺傳研究奠定了基礎；Lombardo 等[20]從EMS 誘變群體中篩選出27 個高分子量谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)的M3突變體，研究了HMW-GS 基因敲除在小麥品質和營養上的潛在應用。

雖然國內外已開展了許多關于小麥EMS 誘變的研究，但鮮有利用小麥抗旱品種構建EMS 突變體庫并從中選育抗旱新品種的報道。鑒于此，本研究以全國旱地區試對照品種晉麥47 為試驗材料，利用山西農業大學小麥研究所誘變育種課題組小麥EMS 高效誘變技術進行種子誘變處理，對包含12 272 個單株的M2突變體庫表型性狀進行了調查統計，旨在創制特殊的突變材料，為小麥遺傳研究提供資源。此外，針對晉麥47 株高偏高、品質較差的缺陷，在M7和M8高代誘變材料中篩選出株高較野生型降低且農藝性狀接近野生型的50 份突變材料，利用近紅外分析儀進行品質性狀快速測定，初步篩選出品質性狀優于野生型的突變材料，以期為小麥抗旱品種品質改良與新品種選育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

晉麥47，由山西省農業科學院棉花研究所旱地小麥育種組育成，1995年通過山西省品種審定委員會審定，1998年又分別通過國家及陜西省品種審定委員會的審定，至今仍被作為國家和山西省旱地區試的對照品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘變處理 首先，挑選籽粒均勻一致的晉麥47 純系種子，用0.1%HgCl2處理15 s，滅菌超純水漂洗種子3 次，再用滅菌超純水在20℃條件下浸泡8 h，中間每隔2 h 取出用滅菌超純水清洗1 次；其次，將浸泡后的種子平鋪于濕潤濾紙上，每隔2 h 加入滅菌超純水保持濾紙濕潤，待種子萌發直至露白；然后，用滅菌超純水清洗3 次，將種子放置于陰涼處晾干；最后，將陰干的種子浸泡于0.6%EMS 磷酸緩沖液中，20℃條件下30 r·min－1震蕩6 h。處理完成后加入5%Na2S2O3溶液終止反應，用滅菌超純水清洗3 次，清洗過的種子放置于陰涼處晾干。

1.2.2 田間種植與表型性狀的調查 試驗在山西農業大學小麥研究所韓村試驗基地進行，全生育期無灌溉。2017年9月25日將EMS 處理后的M1種子進行點播，行距0.25 m，株距0.08 m，成熟后每株選取主莖單穗收獲M2種子。2018年9月28日將M2種子每行30 粒點播種植成穗行，行距、株距同上年度，每20 行插入晉麥47 野生型作為對照。2019年在小麥灌漿中后期調查M2每個穗行的株數，觀察并記載株高、株型、育性、穗型、葉型、分蘗、芒、抗病性等表型性狀的突變株數。

M7和M8突變材料共計663 份，是由山西農業大學小麥研究所誘變育種課題組自2010年起利用EMS誘變處理晉麥47 種子，并從誘變后代中篩選獲得的農藝性狀較好的且能穩定遺傳的突變后代。2018年9月28日將M7和M8種子進行雙行區點播，每行40粒，行長2 m，行距0.20 m，株距0.05 m。2019年6月成熟后按材料進行收獲，脫粒后用于品質性狀測定。

1.2.3 籽粒品質性狀的測定 從M7和M8誘變材料中篩選出50 份遺傳穩定、株高低于野生型、綜合農藝性狀較好的突變體，利用DA7200 多功能近紅外分析儀(瑞典波通公司)測定其與野生型籽粒的硬度指數、蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、吸水率、穩定時間、最大拉伸阻力和拉伸面積共8 個品質指標，重復3 次。

1.3 數據分析

利用Microsoft Office Excel 2007 和SPSS 19.0 軟件進行數據的整理和分析。

2 結果與分析

2.1 M2 表型性狀的突變類型與突變率

對M2群體的12 272 個單株表型性狀進行調查，發現3 711 個突變單株，主要包括莖稈性狀突變、育性突變、穗型突變、抗病性突變、葉性狀突變、生育期突變、芒性狀突變和其他一些突變，總突變率為30.24%(表1)，突變類型豐富。其中，育性、株高和穗型的突變體數量最多，分別為923 株、768 株和742 株，其突變率分別為7.52%、6.26%和6.05%。部分表型突變體如圖1所示。

表1 M2 群體的突變類型及突變率Table 1 Mutation type and mutation rate of M2 population

2.1.1 莖稈性狀突變 晉麥47 野生型在本試驗田內株型緊湊，株高74 cm 左右，6～10 個分蘗。M2群體中觀察到1 293 株莖稈性狀突變體，突變率為10.54%，包括株高突變(768 株)、分蘗突變(494 株)和株型突變(31 株)3 種類型，突變率分別為6.26%、4.03%和0.25%。

株高突變中，一類表現為矮稈突變(圖1－A－1、2、3、4、8)，突變體株高變異范圍為9～64 cm，共595 株，突變率為4.85%。其中，圖1－A－1、2、4 類型的矮桿突變體有效分蘗數較野生型減少；圖1－A－3 類型的矮桿突變體有效分蘗數較野生型增加；圖1－A－8 類型的矮桿突變體為極矮株，株高約9～12 cm，表現為叢生，分蘗較多，但植株節間不伸長，穗被包裹在葉鞘內，結實率低。另一類表現為高稈突變(圖1－A－6、7)，突變體株高約81～99 cm，共173 株，突變率為1.41%。

分蘗突變中，包含單蘗突變體(圖1－B－1)172 株，表現為單株僅有主莖，無分蘗，突變率為1.40%；寡蘗突變體(圖1－B－2、3)321 株，表現為單株分蘗僅2～3個，突變率為2.62%；多蘗突變體(圖1－B－4)1 株，單株分蘗多達19 個，突變率為0.01%。

株型突變中，一種突變體株型表現為半緊湊(圖1－C－1)，共17 株，突變率為0.14%；一種突變體株型表現為松散(圖1－C－2)，共14 株，突變率為0.11%。

2.1.2 育性突變 M2群體中觀察到923 株不育突變體，表現為雄性不育，花藥瘦小干癟，花粉不育，突變率為7.52%。其中424 株突變體表現為完全不育(圖1－D－1、2、3、4)，穗型瘦弱單薄，突變率為3.46%；499 株突變體部分不育，表現為上部與下部小穗不育(圖1－D－5、6)，突變率為4.07%。

2.1.3 穗型突變 晉麥47 野生型為長方形穗，平均穗長7～9 cm。M2群體中觀察到穗型突變體742 株，突變率為6.05%。主要有6 種突變類型:大方穗突變(圖1－E－8、9、11)，突變體穗長約10～12 cm，長方形穗，穗碼較密，共122 株，突變率為0.99%。擬斯卑爾脫小麥穗型突變(圖1－E－7)，突變體與斯卑爾脫小麥穗型相似，穗長約9.5～10.5 cm，穗碼稀，穎殼較硬，外穎有芒，成熟后穗軸易斷，共107 株，突變率為0.87%。尖穗突變(圖1－E－10)，突變體穗細長呈錐形，約9～12 cm，穗碼較稀，共303 株，突變率為2.47%。短穗突變，共196 株，突變率為1.60%。其中，一類突變體穗型與對照相似，但穗長變短，約5～6 cm(圖1－E－3、4)；另一類表現為極短穗(圖1－E－1、2)，形似紡錘，穗長約3～5 cm，結實粒少。密穗突變(圖1－E－6)，突變體穗長約7～8 cm，穗上部小穗著生緊密，呈大頭狀，穗下部表現正常，共8 株，突變率為0.07%。卷穗突變(圖1－E－5)，突變體籽粒飽滿，穗軸中部發生側彎，芒彎曲不直挺，共6 株，突變率為0.05%。

圖1 M2 群體部分突變體Fig.1 Partial mutants of M2 population

2.1.4 抗病性突變 晉麥47 野生型表現為感白粉病，中感條銹、葉銹M2群體中觀察到267 株抗病性與野生型發生變化的突變株，突變率為2.18%。主要包括3 種類型的抗病性突變:白粉病抗性突變，27 株中感白粉病(圖1－F－1)、1 株中抗白粉病(圖1－F－2)和226 株高感白粉病(圖1－F－3)，突變率分別為0.22%、0.01%和1.84%。銹病抗性突變，共發現2 株突變體高感條銹，10 株高感葉銹，突變率分別為0.02%、0.08%。穎枯病抗性突變，發現1 株突變體小穗上部的穎殼有深褐色斑點，感染穎枯病，突變率為0.01%。

2.1.5 葉性狀突變 晉麥47 野生型葉片上舉，顏色深綠。M2群體中觀察到葉片性狀突變體224 株，突變率為1.83%。其中，84 株窄葉突變(圖1－G－1)，旗葉較對照變窄三分之一左右，葉片上舉，植株透光性好，突變率為0.68%；33 株卷葉突變(圖1－G－2)，旗葉靠近莖稈部位表現為褶皺，葉片中部扭轉，突變率為0.27%；107 株寬葉突變(圖1－G－3)，旗葉較對照寬0.5 cm 左右，葉片變厚，上舉，突變率為0.87%。

2.1.6 生育期突變 晉麥47 野生型后期灌漿快，葉片鮮綠，穗呈黃綠色。M2群體中觀察到116 株生育期突變體，突變率為0.95%。主要包括:晚熟突變體(圖1－H－1)，多為矮化突變株，葉片持綠性強，但籽粒灌漿速度慢，成熟期推遲3～5 d，共98 株，突變率為0.8%。早熟突變體(圖1－H－2)，植株在灌漿后期迅速失綠，籽粒脫水速度變快，生育期提前2～3 d，共18株，突變率為0.15%。

2.1.7 芒性狀突變 晉麥47 野生型表現為長芒，芒色淺白。M2群體中觀察到27 株芒性狀突變體，突變率為0.22%。包含無芒突變體、黃芒突變體(圖1－I－1)與褐芒突變體(圖1－I－2)各9 株，突變率均為0.07%。

2.1.8 其他類型的突變 此外，還觀察到葉黃化突變、葉黃斑突變與表皮蠟質突變。有10 株突變體僅葉尖部黃化，影響光合作用，突變率為0.08%(圖1－J－1)；有11 株突變體整株葉片全部黃化，籽粒灌漿受阻，突變率為0.09%(圖1－J－2、3)。葉黃斑突變(圖1－J－4)共9 株，突變體葉片上密布著細小的黃色斑點，斑點內部逐漸失綠干枯，而后擴大致整個葉片干枯，突變率為0.07%。表皮蠟質突變體(圖1－K－1、2)，與野生型相比，突變體旗葉葉鞘表面覆蓋著一層較厚的白霜狀蠟質，旗葉背面也有少量分布，植株顏色呈灰綠色，共89 株，突變率為0.73%。

2.2 高代突變材料籽粒性狀的變異

2.2.1 籽粒形態的變異 晉麥47 野生型籽粒較長，色偏白，呈橢圓型，飽滿度較好，腹溝較淺。從50 份M7和M8突變材料主要觀察到以下突變:粒形突變，突變體籽粒形狀較野生型呈現為方形(圖2－A－1)、卵圓形(圖2－A－2)和錐形(圖2－A－3)；粒長突變，一些突變體籽粒長度較野生型變短(圖2－B－1、2)，一些較野生型變長(圖2－B－3、4、5)；飽滿度突變，與野生型相比，一種突變體籽粒腹溝變深(圖2－C－1)，一種籽粒飽滿度降低，籽粒較癟(圖2－C－2)，另一種籽粒飽滿度增加，籽粒圓潤(圖2－C－3)；粒色突變，與野生型相比，部分突變體粒色偏白(圖2－D－1)，部分突變體粒色偏紅(圖2－D－2)。

2.2.2 品質性狀的變異 8 個品質性狀可以被分為籽粒品質(硬度指數、蛋白質含量)和小麥粉品質(濕面筋含量、沉降值、吸水率、穩定時間、最大拉伸阻力、拉伸面積)兩類指標[21]。由表2可知，50 份M7和M8突變材料的兩類指標均較野生型發生了不同程度的變異，且除吸水率外，其余性狀均有一定比例的材料產生了正向變異。其中穩定時間、拉伸面積、最大拉伸阻力和沉降值的變異系數最高，說明這4 個性狀在誘變后產生了豐富的變異類型，在突變材料中篩選到目標性狀突變體的概率較大。

表2 50 份M7 和M8 突變材料品質性狀的變異表現Table 2 Variation of quality characters of fifty M7 and M8 mutants

籽粒品質指標中，50 份M7和M8突變材料的硬度指數和蛋白質含量平均值較野生型分別下降15.88%和4.18%，變異系數分別為11.14%和10.86%。其中，硬度指數發生正向變異的材料僅為2 個，說明從EMS 誘變后代中選擇硬度指數高于野生型的概率較低；蛋白質含量發生正向變異的比例為38.00%，說明通過EMS 誘變可有效對晉麥47 的蛋白質含量進行改良。

小麥粉品質指標中，50 份M7和M8突變材料的濕面筋含量、沉降值、吸水率和穩定時間平均值較野生型分別降低3.81%、7.31%、6.82%和17.56%；最大拉伸阻力和拉伸面積的平均值較野生型分別增加5.87%和6.28%。從變異系數來看，各性狀表現為穩定時間(37.76%) >拉伸面積(34.31%) >最大拉伸阻力(32.03%)>沉降值(27.56%)>濕面筋含量(9.58%)>吸水率(3.44%)。其中穩定時間的最大值較野生型提高了56.91%，與之類似突變材料中沉降值、最大拉伸阻力、拉伸面積的最大值分別較野生型提高了68.56%、84.85%和111.39%，且發生正向突變的比例分別為28%、28%、36%和40%，說明在誘變后代中可能較易篩選出這4 個性狀優于野生型的突變體。

綜合考慮上述各項品質指標，在50 份M7和M8突變材料中初步篩選出了4 份材料，其綜合品質性狀優于野生型，且株高較野生型低，農藝性狀較好。

3 討論

當前，EMS 作為植物誘變育種中最常用、最有效的一種化學誘變劑，能夠快速誘發植物基因突變，被廣泛地用于構建小麥突變體庫[22－23]。王長里[24]利用0.3%EMS 溶液處理小麥河農822 的種子，在21 048株M2誘變群體中觀察到3 063 株突變體，突變率為14.6%。；徐艷花等[25]利用0.8%EMS 溶液處理小麥豫農201 的種子，從6 305 個M2誘變群體中獲得了722份葉、莖、穗、籽粒等性狀變異的突變體，總突變率為9.17%；倪永靜等[26]利用0.4% EMS 溶液處理國麥301 的種子，從12 020 個M2穗系中篩選出769 個突變體，突變率為6.398%。本研究利用0.6%EMS 溶液誘變種子構建了晉麥47 的突變體庫，從12 272 株M2成苗中觀察到3 711 株表型性狀突變體，總突變率為30.24%。本研究中，M2突變率明顯高于現有報道，這可能與供試品種及EMS 誘變方法的創新有關。本研究基于種子萌發各階段對EMS 的敏感程度存在較大的差異，尤以幼嫩的分生組織對EMS 誘導最為敏感這一原理[27]，前期對種子進行預處理，使其萌發至露白，利用EMS 溶液處理露白的種子，最終大幅提高了EMS誘變率。

本研究結果表明，從M2中觀察到莖稈性狀、穗型、葉片性狀、芒部性狀、生育期、育性和抗病性等方面共32 種突變類型。其中，育性、株高和穗型的突變株數最多，誘變效應最為明顯，突變率排序為:育性>株高>穗型。趙天祥等[28]對偃展4110 M2突變體庫的研究也證實了育性的突變率最高，這說明控制育性的基因經過EMS 誘變后最易發生突變；陳亮[29]利用0.8%EMS 溶液處理晉麥47 的種子得到M2共2 610 個單株，發現表型變異中株高變異最多，且全部表現為矮稈和半矮稈的突變，而本研究中株高突變雖以矮桿突變體居多，但也存在部分高稈突變，研究結果的差異可能與誘變群體數量及誘變方法的差異有關。

蠟質材料因其表皮覆蓋著一層白霜狀蠟質，能夠控制表皮非氣孔性的水分散失和氣體交換，與植物的抗旱節水性相關[30－32]，具有抵御多種生物和非生物脅迫的功能[33]。楊彥會等[34]研究了干旱脅迫對不同蠟質含量小麥近等基因系光合性能的影響，發現蠟質含量對提高小麥的抗旱性有積極影響，并且在中度和重度干旱脅迫條件下，多蠟質品系較少蠟質品系的抗旱節水性更加顯著。Li 等[35]研究也表明蠟質缺失突變體w5 較野生型濟麥22 對干旱條件更為敏感。本研究在干旱脅迫條件下發現了蠟質含量高于野生型的突變體，結合前人研究結論推斷在脅迫條件下，蠟質含量高的突變體抗旱性可能會優于野生型；研究還在相同環境條件下發現了極矮化、單蘗、早衰突變體，推測其抗旱性較野生型可能有所減弱。這些特殊突變體的發現不僅豐富了小麥抗旱資源庫，也為小麥抗旱分子機理及功能基因的發掘提供了寶貴的研究材料。然而，M2突變材料存在繼續分離的現象，對于這些特殊突變性狀是否能夠穩定遺傳，需要待M3至M5遺傳穩定后進行進一步驗證。如果能夠穩定遺傳，可以將野生型作為輪回親本與優良突變體進行連續回交達到性狀改良的目的，在后代中篩選出具有目標性狀且綜合農藝性狀優良、遺傳穩定的單株，直接作為抗旱小麥新品系加以利用。

隨著小麥單產水平的逐步提高，品質改良已成為當前育種工作的焦點之一。利用EMS 對小麥種子進行誘變處理，從誘變后代中篩選品質較好的突變材料，可以有效打破基因連鎖，為小麥品質育種提供新的資源，從而提高優質小麥新品種選育效率[14]。薛芳等[36]利用EMS 誘變處理新春11 小麥種子，發現0.7%EMS 處理下高抗性淀粉含量的突變體更為豐富，并篩選出7 個抗性淀粉含量高且綜合性狀優良的M2突變材料；徐艷花等[25]使用0.8%EMS 誘變豫農201種子，從930 個株系中篩選出21 個HMW-GS 缺失突變株系；于利偉等[37]對小麥優質品種西昌69 進行EMS 誘變，使用近紅外谷物分析儀對1 667 個M6材料進行品質性狀測定，篩選出28 個籽粒品質性狀優于誘變親本的突變材料，并認為借助近紅外谷物分析儀從大量誘變后代中進行初步篩選，可有效提高小麥優質品種選育效率。本研究為快速篩選出農藝性狀較好且品質性狀優于野生型晉麥47 的突變材料，從663 份M7和M8突變體中篩選出株高低于野生型的50 份材料，利用近紅外谷物分析儀進行品質性狀分析，發現穩定時間、拉伸面積、最大拉伸阻力、沉降值和形成時間的變異系數較高，且發生正向突變的比例也相對較高，說明EMS 誘變對小麥品質性狀的影響較大，在誘變后產生了豐富的變異類型，為小麥品質性狀的改良提供了較大的選擇空間。其中，穩定時間的變異系數最大，與于利偉等[37]對小麥M6品質性狀的測定結果一致，這是由于穩定時間受多個基因位點調控[38]，經過EMS誘變后發生突變的位點相對于其他性狀較多。此外，本研究初步篩出4 個綜合品質性狀均優于野生型且農藝性狀較好、株高較低的突變體，下一步計劃將其種植于不同環境中，利用國家標準對其品質性狀進行驗證，以確認其品質性狀的突變能夠穩定遺傳。

4 結論

本研究利用改進的EMS 誘變技術構建了旱地小麥晉麥47 M2表型突變體庫，觀察到了莖稈性狀、穗型、葉片性狀、芒部性狀、生育期、育性和抗病性等32種突變類型，總突變率達30.24%，為小麥抗旱分子機理及功能基因的發掘提供了豐富的遺傳材料。其中大穗、矮桿、多蘗、蠟質、大粒和籽粒飽滿的優良突變體，為旱地小麥的遺傳改良奠定了材料基礎。此外，50 份M7和M8誘變材料籽粒的形態和品質均發生了不同程度的變異，并初步篩選出了4 份農藝性狀優良且綜合品質性狀優于野生型的突變體材料。