基于葉片解剖結構的京津冀主栽板栗品種抗旱性評價

郭 燕 張樹航 李 穎 張馨方 王廣鵬

(河北省農林科學院昌黎果樹研究所，河北秦皇島 066600)

板栗(Castanea mollissimaBl.)是我國主要的堅果樹種，廣泛分布于我國各地山區。其中，京津冀是我國板栗的優勢主產區，栽培面積占全國總面積的20%以上，板栗已成為京津冀山區農民經濟收入的重要支柱樹種。干旱一直是危害京津冀板栗生產的主要因素之一[1]。因此準確評價品種抗旱性，篩選利用抗旱性強的品種，對實現京津冀山區栗園高產優質生產具有重大意義。

抗旱性是指植物在干旱環境中生長、繁育或生存的能力，以及在干旱解除后迅速恢復的能力[2]。植物的抗旱性是在形態結構、生理和生化等各方面綜合表現的遺傳特性[3]。生理生化指標易受環境因子短暫變化的影響而表現出異常的變化，而植物的形態及解剖結構是在長期特定環境條件下適應并演化的結果，不會隨環境因子的暫時改變而發生較大的變化[4－5]。葉片是植物直接暴露于空氣中面積最大的器官，在外界生態環境的長期影響下，通常會形成多種抗旱適應形態，影響植物的光合特性及水分運輸和利用系統[6－7]。相關研究表明，植物的抗旱性與葉片厚度、上下表皮細胞厚度、柵欄組織厚度、柵海比、組織結構緊密度、氣孔密度等呈正相關，與海綿組織厚度、組織結構疏松度等呈負相關[3，8－13]。葉片解剖結構指標已被廣泛應用于山核桃(Carya cathayensis)[4]、楊樹(PopulusL.)[6]、蘋果(MalusMill.)[11]、葡萄(Vitis vinifera)[14]、沙棘(Hippophae rhamnoidesLinn.)[15]等多種林果樹種的抗旱性鑒定。另外，葉片保水力也是重要抗旱性鑒定指標，具有測定方法簡單、重復性好、樣本容量大的優點，在造林樹種[16]、楸樹[17]和烤煙[18]等抗旱性鑒定中已取得較好的應用效果。

目前，有關板栗品種抗旱性鑒定的研究多集中于生理指標篩選和少數幾個品種抗旱性比較。李鈞[19]研究了水分脅迫后板栗苗木丙二醛－脯胺酸－保護酶活性的變化。鄭龍等[20]和武燕奇等[21]分別通過葉片電導率和解剖結構及氣孔特征指標比較了7 個和10個板栗品種的抗旱性?？购敌允嵌鄠€性狀綜合作用的結果，需要根據多個性狀綜合評價，而且植物的抗旱性由于地域和采用方法不同所得結果也有所不同。京津冀地區氣候環境類似，板栗栽植品種一直通用，而有關京津冀栽植品種抗旱性鑒定、篩選方面的研究，至今鮮見報道。本研究選取京津冀板栗產區的36 個主栽品種，通過對其葉片相關抗旱解剖結構、氣孔和葉柄葉脈特征的篩選分析，綜合評價各品種抗旱性強弱，旨在為京津冀主栽板栗品種的生產規劃和高效利用創新提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

河北省農林科學院昌黎果樹研究所板栗種質資源圃，地處118°51′E，39°53′N，屬中國東部季風區暖溫帶半濕潤大陸性氣候。試驗地2018年7月平均氣溫25.9℃，1月最低平均氣溫－5.5℃，年平均氣溫11.9℃，日較差10.3℃，≥10℃年積溫4 410℃；年均降水量478.7 mm，年均相對濕度59%，無霜期187 d；年日照時數2 719.7 h；海拔20 m，土壤類型為沙壤土。

1.2 試驗品種

分別選取在京津冀板栗栽培面積超萬畝的品種為試驗對象，共36 個(表1)，所有試驗品種均是在2004年統一嫁接于3年生燕山早豐實生砧木上，株行距4 m×4 m，各品種植株修剪、肥水及病蟲害防控等管理措施一致。

1.3 試驗材料

2018年7月15日，選取每個板栗品種生長勢基本一致的3 株，選擇每株東向冠層外圍中部1年生營養枝3 條，在其上選取第7～第9 節位健康、成熟葉片3 片，共27 片，以密封袋密封后置于冰盒帶回實驗室，隨機選取10 片立即用于葉片保水力的測定；選取10片立即用于葉柄、葉脈、氣孔特征的觀測；隨機選取5片用錫箔紙平展包好，液氮速凍后放入－80℃冰箱用于葉片解剖結構觀測。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 葉片保水力的測定 葉片保水力的測定采用離體葉片自然失水法[18]。

1.4.2 葉片解剖結構的觀測 采用冷凍切片法制作切片，在Olympus BX51 光學顯微鏡(日本奧林巴斯)下進行觀察拍照。每品種1 個葉塊選取完整平展的1個切片，共5 個(5 次重復)，每個切片拍3 個視野。使用SPOT 圖像測量軟件測量并計算16 項葉片內部解剖結構指標:葉片厚度(leaf thickness，LT)、上表皮角質層厚度(cuticle thickness of upper epidermis，CTU)、上表皮細胞厚度(thickness of upper epidermis cell，TU)、第一層柵欄組織細胞密度(the first layer of palisade tissue cell density，FPD)、第一層柵欄組織細胞長度(the first layer of palisade tissue cell length，FPL)、第二層柵欄組織細胞長度(the second layer of palisade tissue cell length，SPL)、柵欄組織厚度(thickness of palisade tissue，TP)、海綿組織厚度(thickness of spongy tissue，TS)、下表皮細胞厚度(thickness of lower epidermis cell，TL)、下表皮角質層厚度(cuticle thickness of lower epidermis，CTL)。參照徐揚等[11]的方法計算柵海比(P/S)、葉片組織結構緊密度(tightness of leaf structure，TLS)和葉片組織結構疏松度(looseness of leaf structure，LLS)。

1.4.3 葉片氣孔大小和密度的觀測 參考指甲油印跡法[4]制片，在Olympus BX51 光學顯微鏡下觀察拍照，每品種制作5 個裝片，每個裝片拍3 個視野。用SPOT 圖像測量軟件對氣孔長度(stoma length，SL)、氣孔寬度(stoma width，SW)、氣孔密度(stoma density，SD)進行測量統計。參照郭學民等[22]方法計算氣孔周長(stoma perimeter，SP)和單位面積氣孔總周長(the total stoma perimerer per unit area，SPA)。

1.4.4 葉柄及葉脈的觀測 先使用惠普掃描儀在200 分辨率模式下將每個葉片掃描成圖片，每個品種掃描10 個葉片(10 次重復)，然后使用萬深LA-S 葉片多功能圖像分析軟件分析圖片，得到葉柄長(petiole length，PL)、葉柄寬(petiole width，PW)、葉柄長/寬(L/W)、葉片長(leaf length，LL)4 項指標，葉脈間距(spacing length of veins，VSL)計算公式為:VSL＝LL/單邊葉脈數＋1。

1.5 數據處理與分析

運用Excel 2010 和SPSS 20.0 對數據進行處理和方差及相關性分析，采用主成分分析法篩選典型指標并確定其權重，運用隸屬函數法結合各典型指標權重綜合計算36 個板栗品種抗旱性度量值(D值)[23]。參照何偉[24]的方法，依照D值將板栗抗旱性分為5 級:0.60～0.80 為高抗(high resistance，HR)，1 級； 0.50～0.59 為抗(resistance，R)，2 級；0.30～ 0.49 為中抗(middle resistance，MR)，3 級；0.20 ～ 0.29 為低抗(lower resistance，LR)，4 級； 0 ～ 0.19 為不抗(susceptible，S)，5 級。

2 結果與分析

2.1 葉片保水力比較

葉片保水力是葉片在離體狀態下保持原有水分的能力，葉片保水力越強，抗旱性越強。36 個板栗品種葉片保水力由大到小排列如圖1所示。各品種葉片保水力在20%～70%之間，其中燕寶、煙青、大青裂、煙泉、燕麗、京暑紅、燕昌、燕紅和良鄉1 號的葉片保水力值均低于30%，抗旱性較差；燕龍、燕晶、燕寬和燕金均高于60%，抗旱性較好。

圖1 36 個板栗品種離體葉片保水力Fig.1 The water retention capacity of excised leaves of 36 chestnut cultivars

2.2 葉片結構特征比較

2.2.1 葉片厚度比較 葉片厚度常作為植物抗旱性評價指標之一。由表1可知，36 個板栗品種葉片厚度之間均存在極顯著差異(P<0.01)，且變異系數也較高(10.56%)，說明葉片厚度適用于板栗抗旱性分析。各品種葉片厚度變化范圍為150.19～240.14 μm，最厚(燕龍)比最薄葉片(燕寶)厚59.89%，其中燕寶和煙青葉片厚度較小，分別為150.19 和151.51 μm，燕金、燕寬、燕晶和燕龍的葉片厚度相對較大，分別為205.78、209.75、209.33 和240.14 μm。

表1 36 個板栗品種葉片厚度與表皮特征Table 1 Leaf thickness and epidermis characters of 36 Chestnut cultivars

2.2.2 葉片表皮特征比較 由圖2可知，板栗葉片均表現出上表皮茸毛較少、下表皮茸毛較密。由圖3可知，表皮由單層細胞構成，具有角質層，上、下表皮細胞均呈長方形，上表皮細胞明顯大于下表皮細胞。由表1可知，各品種葉片上表皮角質層厚度均較下表皮大，上表皮角質層厚度在4.40～6.45 μm 之間，燕麗最薄，東陵明珠最厚；下表皮角質層厚度在1.41～3.26 μm之間，懷豐最薄，燕豐最厚；方差分析結果表明，上表皮角質層厚度和下表皮角質層厚度在各品種之間無顯著差異，不適用板栗抗旱性分析。各品種葉片上表皮均較下表皮細胞厚度大，上表皮細胞厚度在20.61～36.05 μm 之間，東陵明珠最薄，京暑紅最厚；下表皮細胞厚度在3.78～7.33 μm 之間，遷西早紅最薄，燕龍最厚；方差分析表明，上表皮細胞厚度和下表皮細胞厚度在各品種之間差異達到極顯著水平(P<0.01)，說明這兩項指標適用于板栗抗旱性分析。

圖2 板栗葉片表面茸毛特征Fig.2 The leaf pubescence characteristics of chestnut

圖3 板栗葉片厚度和解剖結構的顯微觀察Fig.3 The microscopic observation of leaf thickness and anatomical structure of chestnut

本研究中，各品種葉片上表皮均未見氣孔分布，而下表皮散生大量氣孔，氣孔明顯凸起，為橢圓形或圓形。氣孔器由2 個腎形保衛細胞構成，形狀相似(圖4)。由表1可知，氣孔長度、寬度、密度和單位面積氣孔總周長在各品種間均有極顯著差異(P<0.01)，說明這些指標適用于板栗抗旱性分析。36 個品種的葉片氣孔長度變化范圍為16.86～26.11 μm，平均22.57 μm，最大值較最小值大54.88%；氣孔寬度介于15.96～23.30 μm，平均21.18 μm，最大值較最小值大46.05%；氣孔密度介于772.97～1 281.47 個·mm－2，平均964.44 個·mm－2，最大值較最小值大65.79%；單位面積氣孔總周長介于32.56～61.72 mm，平均43.58 mm，最大值較最小值大89.56%。

圖4 板栗葉片下表皮氣孔密度差異Fig.4 Difference of stomatal density in lower epidermis of chestnut leaves

2.2.3 葉肉解剖結構特征比較 由圖3可見，板栗葉片柵欄組織有2～3 層細胞，長圓柱狀，垂直于上表皮細胞，并排列緊密，而海綿組織細胞形狀多樣，排列疏松，存在細胞間隙。葉肉解剖相關指標中(表2)，36個板栗品種間只有柵欄組織密度無顯著差異，不適于抗旱性分析，而其他7 個指標在各品種之間均存在極顯著差異(P<0.01)，適于進一步進行板栗抗旱性分析。各品種葉片的第一層柵欄組織細胞長度在38.40～73.05 μm 之間，最長品種較最短品種長90.23%；第二層柵欄組織細胞長度在21.14～34.68 μm 之間，最長品種較最短品種長64.04%；柵欄組織厚度在60.48～106.27 μm 之間，平均77.87 μm，其中燕龍、燕晶、遵化短刺和燕金較厚，均在90.00 μm 以上，煙泉最?。缓＞d組織厚度在40.41～87.65 μm 之間，平均60.09 μm，燕紅最薄，燕龍最厚；柵/海在0.98～2.10 之間，燕光最小，燕紅最大；葉片結構緊密度在34.18%～51.64%之間，紫珀最小，燕麗最大；葉片結構疏松度在24.49%～40.74%之間，燕紅最小，津早豐最大。

表2 36 個品種板栗葉肉解剖結構特征Table 2 Mesophyll characters of 36 Chestnut cultivars

2.2.4 葉柄和葉脈間距特征比較 葉柄的長度、寬度、長/寬和葉脈間距與植物抗旱性有著不可分割的關系。由表3可知，葉柄長、葉柄寬、葉柄長/寬和葉脈間距在36 個板栗品種間變異系數較大且均有極顯著差異(P<0.01)。各品種的葉柄長為16.37～31.70 mm，其中最大值是最小值的1.9 倍；葉柄寬為4.11～7.31 mm，最大值是最小值的1.8 倍；葉柄長/寬為3.06～7.45，最大值是最小值的2.4 倍；葉脈間距為7.62～14.11，最大值是最小值的1.9 倍。

表3 36 個板栗品種葉柄和葉脈間距特征Table 3 Petiole and spacing length of veins characters of 36 Chestnut cultivars

2.3 不同板栗品種抗旱性綜合評價

2.3.1 葉片結構特征指標篩選 用主成分分析法將各品種間存在極顯著差異的18 項葉片結構指標進一步進行篩選，依據累計貢獻率≥85%的原則抽取主成分。結果顯示(表4)，前6 個主成分的累計貢獻率達到85.844%，較好地概括了18 項指標的大部分信息，因此提取前6 個主成分。各指標對應于6 個主成分因子載荷有極大差異，絕對載荷值越高的指標對主成分的貢獻越大，典型性越強，同時依據6 個主成分的權重求得綜合得分值F 的表達式系數[23]，即F＝0.210 LT＋0.168 TU＋0.128 TL＋0.034 SL＋0.028 SW＋0.020 SD＋0.037 SPA＋0.168 FPL＋0.144 SPL＋0.173 TP ＋0.141 TS＋0.016 P/S ＋0.052 TLS ＋0.047 LLS ＋0.026 PL ＋0.034 PW－0.012 L/W＋0.056 VSL，該表達式中，指標前系數為正數，說明該指標與F 呈正相關，即與抗旱性呈正相關，反之則呈負相關；指標前系數絕對值即為權重，權重越大，越能反映植物抗旱性。由表4可知，第1 主成分中絕對載荷值較大且彼此間相關性較強的指標是第一層柵欄組織細胞長度(FPL，0.897 )、第二層柵欄組織細胞長度(SPL，0.734 )和柵欄組織厚度(TP，0.911 )，其中TP 在F 值表達式中的系數絕對值最大(＋0.173 )且為正數，因此被選為第一主成分典型指標，其與抗旱性呈正相關。相同方法篩選出葉片厚度(LT，0.892 )為第2 主成分的典型指標、單位面積氣孔總周長(SPA，0.705 )為第3 主成分的典型指標、葉柄長(PL，0.548 )為第4 主成分典型指標、葉脈間距(VSL，0.547 )為第5 主成分的典型指標、上表皮細胞厚度(TU，0.630 )為第6 主成分的典型指標，各典型指標均與抗旱性呈正相關。

表4 主成分載荷矩陣表Table 4 Principal components matrix

2.3.2 抗旱性綜合評價 由主成分分析可知，篩選的6 項典型指標(葉片厚度、柵欄組織厚度、單位面積氣孔總周長、葉柄長、葉脈間距和上表皮細胞厚度)均與抗旱性呈正相關。進一步運用隸屬函數法結合各指標的權重計算每個品種6 項典型指標的抗旱性度量值(D)，D值越大，抗旱性越強。按照D值大小標準將36 個品種抗旱性劃分為5 個等級類型(表5):高抗旱類型(HR)有燕龍、燕晶、燕金和燕寬；抗旱類型(R)有燕奎、津早豐、燕明、燕紫、東陵明珠、遵化短刺、大板紅、遵達栗、燕山短枝和冀栗1 號；中抗旱類型(MR)有遵玉、燕山早豐、燕興、紫珀、邢豐1、燕豐、燕秋、懷九、遷西早紅、燕光、燕平、懷豐和雜35；低抗旱類型(LR)有燕紅、大青裂、京暑紅、燕麗、燕昌和良鄉1 號；不抗旱類型(S)有煙泉、煙青和燕寶。

表5 36 個板栗品種6 項典型指標的隸屬函數值和抗旱性度量值(D)Table 5 Membership function values and drought resistance measurements of 6 typical indexes of 36 chestnut varieties (D)

進一步相關性分析表明，36 個品種6 項典型指標的抗旱性度量值(D)與其葉片保水力之間呈極顯著正相關(r＝0.957**)，說明采用隸屬函數法結合6 項典型指標權重計算的抗旱性度量值對各品種的抗旱性等級劃分結果和采用葉片保水力評價板栗抗旱性結果較為一致。

3 討論

植物葉片解剖結構是葉片保水以滿足自身生理代謝的重要物質基礎[6]。不同植物葉片解剖結構特征與抗旱性的關系不盡相同[2，15]。橄欖葉片柵欄組織和海綿組織厚度越厚、氣孔和表皮毛密度越大，其抗旱性越強[25]；鵲腎樹葉片角質層、柵欄組織和葉片越厚，其抗旱性越強[26]；甘蔗葉片厚度、表皮和葉肉厚度越厚、氣孔和葉脈密度越大，其抗旱性越強[27]；蘋果屬植物葉片上下表皮細胞厚度、柵欄組織厚度、柵海比和葉片結構緊密度與其抗旱性呈正相關，而海綿組織厚度和葉片疏松度與抗旱性呈負相關[11]。本研究發現，板栗葉片厚度、柵欄組織厚度、上表皮細胞厚度、單位面積氣孔總周長和氣孔密度與抗旱性均呈正相關，與觀賞灌木[9]、扁桃[10]、蘋果[11]、鵲腎樹[26]、榛[28]等植物上取得的研究結果基本一致；板栗葉柄長度與抗旱性呈正相關，這與王沛雅等[29]在楊樹上的研究結果一致，可能是因為葉柄較長的葉片容易發生扭轉運動可避免較強陽光直射，從而減少了水分蒸發；海綿組織厚度和葉片結構疏松度與板栗抗旱性呈正相關的結果與在蘋果屬植物上的研究結果不同[11]，但與Ennajeha 等[25]

在橄欖上的研究結果基本一致，其認為葉片柵欄組織和海綿組織均較厚的橄欖抗旱性較強，是因為較厚的柵欄組織可能含有較多的CO2固定位點，而較厚的海綿薄壁組織可能促使CO2更容易擴散到這些位點，從而更有利于提高光合作用來增強抗旱性，板栗葉片結構越疏松、海綿組織越厚其抗旱性越好，推測其可能與此類似。另外，Qin 等[27]發現高抗旱甘蔗品種的葉脈密度明顯高于低抗旱品種，而本研究發現葉脈間距與板栗抗旱性呈正相關，即抗旱性較強品種葉脈間距較大(葉脈密度較小)，這可能是因為較大的葉脈間距能使葉片具有相對較大的葉肉面積用來進行光合作用從而增強了抗旱性，同時也說明由葉脈主要負責的水分和養分運輸系統可能不是板栗提高抗旱性的“短板”，葉柄寬度對板栗抗旱性的影響較小也進一步佐證了這一觀點。從本研究結果來看，對板栗抗旱性影響較大的葉片解剖結構指標均具有獨特的水分和碳同化優勢，比如葉片厚度、柵欄組織和上表皮細胞厚度反映了葉片的儲水性，柵欄組織富含葉綠體主要提升葉片的光合能力，單位面積氣孔總周長和氣孔密度通過影響葉片內外氣體交換和水分散失調控葉片的光合作用和蒸騰作用，推測板栗的抗旱性和其光合能力具有密切協同性，光合能力較強的板栗可能具有較高的滲透調節物質、抗氧化物質及激素等與植物抗旱性生理生化相關物質的背景水平。

植物的抗旱性用單一指標難以全面準確地反映各品種抗旱性強弱[30]，然而選入較多指標會因指標間存在的多重共線性而使信息有一定重疊或是產生認識上的偏差[31]，因此需用科學的方法從一系列指標中篩選出彼此相對獨立的典型指標來進行抗旱性分析。本研究通過方差分析、主成分分析從21 項葉片解剖結構指標中篩選出與板栗抗旱性密切相關的葉片厚度、柵欄組織厚度、單位面積氣孔總周長、葉柄長、上表皮細胞厚度和葉脈間距6 項指標，可作為典型指標來分析板栗的抗旱性。同時，由于各典型指標對抗旱性的貢獻(權重)不一樣，因此運用隸屬函數法結合各典型指標的權重計算出的抗旱性度量值是較為準確可行的抗旱性評價方法[23，32－33]。本研究按照抗旱性度量值大小將36 個品種抗旱性劃分為5 個等級類型，而且36 個板栗品種運用隸屬函數法結合6 項典型指標權重計算的抗旱性度量值與葉片保水力值呈極顯著正相關(r＝0.957**)，說明兩種方法的評價結果較為一致。前期，郭素娟等[23]通過研究板栗葉片解剖結構認為燕龍、大板紅和燕奎品種抗旱性強，燕山早豐和紫珀抗旱性中等，這與本研究中對該5 個品種的抗旱性劃分基本一致。鄭龍等[20]測定了板栗離體葉片在干旱脅迫處理下電導率的變化，研究結果表明品種燕紅的抗旱性較差，這與本研究中對其的抗旱性評價結果也一致，進一步說明采用隸屬函數法結合6 項典型指標的權重計算出的抗旱性度量值和葉片保水力均能夠較為準確地評價和區分板栗抗旱性，但由于葉片保水力法具有測定方法簡單、樣本容量大的優點，因此建議在進行板栗大批量樣本抗旱性的初級篩選評價時選用該方法，以提高工作效率。

4 結論

葉片厚度、柵欄組織厚度、單位面積氣孔總周長、葉柄長、上表皮細胞厚度和葉脈間距可作為板栗抗旱性評價的6 項典型指標。本研究利用隸屬函數法結合6 項典型抗旱指標及權重計算出的抗旱性度量值對36個板栗品種抗旱性類別進行了初步劃分，這對京津冀燕山產區板栗品種規劃、抗旱育種親本選擇及抗旱機理研究具有一定參考價值。需要注意的是，植物的抗旱性是受多基因調控的數量性狀，具體可反映在植物的形態及解剖構造、水分生理生態、生理生化反應、內源激素水平等特征上，而本研究對板栗品種抗旱性強弱的劃分僅建立在葉片解剖結構指標和葉片保水力上，未來應結合旱害指數，以及與抗旱相關的生理生化等指標測定加以綜合考慮，以獲得更客觀準確的板栗品種(系)抗旱性結果。