花椰菜AP2/ERF轉錄因子家族成員BobERF17響應逆境脅迫的表達及功能研究

李 慧 楊亞苓 李 聰 李麗紅 韓占品 王春國

(1天津農學院園藝園林學院，天津 300384；2南開大學生命科學學院，天津 300071)

花椰菜(Brassica oleraceaL.var.botrytis L.)又名花菜、菜花，原產于地中海沿岸，是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，花球是其主要食用部分。花椰菜花球中不僅含有維生素C 等營養物質，還富含抗癌、防癌活性成分蘿卜硫素。蘿卜硫素被認為是蔬菜作物中抗癌活性最強的天然成分之一[1]。因此，花椰菜作為一種保健類蔬菜深受廣大消費者的喜愛，自19 世紀傳入我國以來，種植面積逐漸增大[2－3]。目前，我國已成為全球花椰菜種植面積最大、總產量最高的國家。但花椰菜遺傳背景狹窄，我國育種資源匱乏，使得采用傳統雜交育種方式培育高產、優質花椰菜新品種遇到巨大挑戰[4－6]。此外，花椰菜基礎研究仍十分薄弱，人們對其生長發育及逆境響應的分子基礎認識還很有限，限制了基因工程手段在花椰菜種質創制及品種培育中的應用。

APETALA2/乙烯響應因子(APETALA2/ethyleneresponsive factor，AP2/ERF)是廣泛存在于植物中的一類轉錄因子超家族。目前在番茄[7]、蘋果等[8]等多種植物中的ERF 轉錄因子已被成功克隆。研究證實，該家族成員均含有一段由60～70 個氨基酸組成的AP2保守結構域。根據含有AP2 結構域的數目不同，AP2/ERF 超家族可進一步分為AP2、ERF、RAV 及Soloist 四個家族，其中AP2 家族成員含有2 個AP2 結構域，ERF 家族成員含有1 個AP2 結構域。根據AP2結構域內保守氨基酸序列的不同，ERF 家族又可進一步分為ERF 和DREB 兩個亞家族。RAV 家族除具有1 個AP2 結構域外，還含有1 個B3 結構域，而Soloist成員僅含有1 個AP2-like 結構域[9－10]。研究表明AP2家族成員主要在植物花器官發育、種子大小發育等調控中發揮重要作用[11－14]。而ERF 家族成員被證實主要在植物響應逆境脅迫中發揮重要作用。如在水稻(Oryza sativaL.)中過表達OsERF71 可顯著影響水稻根系結構，提高轉化株對干旱的耐受[15]。在煙草中過表達麻瘋樹(Jatropha curcasL.)JcERF1 可以顯著提高轉化株對鹽脅迫的耐受[16]。三葉枳(Poncirus trifoliataL.Raf.)PtrERF109 通過直接調控Prx1 在增強植株耐寒性方面發揮作用[17]。84K 楊樹中ERF38 的過表達可以提高轉基因楊樹對鹽脅迫的耐受性[18]。青花菜(Brassica oleraceaL.var.italic)BrERF2 響應酸雨脅迫[19]，番茄(Solanum lycopersicum)SLERF83、SLERF84和SLERF109 可能在響應生物及非生物脅迫中均有作用[7，20]，在擬南芥(Arabidopsis thanliana)中過表達SLERF84 可以顯著提高轉化株對干旱及鹽脅迫的耐受[20]。本研究前期對花椰菜在不同脅迫處理條件下基因差異表達譜特征進行了分析，發現大量ERF 轉錄因子在受到干旱或鹽脅迫下呈現差異表達[21]，但這些轉錄因子在花椰菜應答逆境脅迫中的功能仍需進一步研究。為此，本研究對其中一個干旱脅迫響應相關ERF 家族成員BobERF17 進行克隆并進一步對其序列、表達特征及功能進行探究，旨在揭示ERF轉錄因子在花椰菜逆境響應中的功能，為開展花椰菜抗逆分子育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花椰菜供試種子津品70 由天津科潤蔬菜研究所孫德嶺研究員惠贈；擬南芥(哥倫比亞生態型)種子，大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株LBA4404、植物表達載體pCAMBIA3301 由南開大學染色體實驗室保存。

1.2 花椰菜幼苗不同逆境脅迫處理

花椰菜種子播種于營養土中，待幼苗長出2～3 片真葉時，分組進行不同脅迫處理，每個脅迫處理設置3個生物學重復。干旱及鹽脅迫參照Li 等[21]的方法。干旱脅迫時，將花椰菜幼苗根部浸在20% 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG 6000)溶液中，分別在0、2、4、8 和12 h 取材。鹽脅迫處理時，將花椰菜幼苗根部浸在200 mmol·L－1NaCl 溶液中，分別在0、4、8、12、24 h取材。前期試驗表明，花椰菜幼苗期的適宜生長溫度約為15～25℃，可耐受38～40℃的高溫和－5～0℃的低溫，但溫度高于40℃或低于－5℃可使幼苗在短時間內就呈現出明顯的溫度脅迫癥狀。為此，高溫脅迫時，將花椰菜幼苗置于光照培養箱中，設定溫度為45℃，光照強度為5 000 Lux，分別于0、4、8、12、24 h 取材；低溫脅迫時，將花椰菜幼苗置于－15℃冰箱中，分別于0、30、60、90、120 min 取材。

1.3 花椰菜DNA 提取

以花椰菜幼嫩真葉為材料，采用CTAB 裂解法[22]提取花椰菜基因組DNA。75%乙醇洗滌DNA 沉淀，無菌水溶解后除去RNA 污染，使用NanoDrop－1000(Thermo Fisher，美國)測定DNA 濃度。

1.4 花椰菜RNA 提取及反轉錄

按照RNA 提取試劑盒(寶生物，大連)操作說明書提取花椰菜總RNA。測定RNA 的濃度及用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，質量檢測合格的RNA 置于－80℃冰箱中保存備用。提取的總RNA 按照M-MLV 反轉錄酶(美國Promega)說明書反轉合成cDNA 第一鏈。

1.5 花椰菜不同脅迫處理條件下BobERF17 表達特征的qRT-PCR 分析

根據BobERF17 編碼區序列設計實時熒光定量反轉錄PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)引物:BobERF17-S:5′GAAGGACGAG GAGATGATGC3′；BobERF17-A:5′ATAATCCCTTGTA GGTGAAAGCT3′，以反轉錄合成的cDNA 為模板，βactin為內參，采用iQ5 PCR 儀(美國Bio-Rad 公司)進行qRT-PCR 分析。每個脅迫處理分別設置3 個生物學重復和技術重復，BobERF17 相對表達量采用2－ΔΔCT法計算。

1.6 BobERF17 植物過表達載體構建

設計帶有酶切位點的BobERF17 擴增引物:NcoIBobERF17-S:5′CCATGGATGGAGGAGGAAGGGTCGT3′；BstE Ⅱ-BobERF17-A:5′GGTCACTCAAAAATTCCAAA GATGCA 3′。以花椰菜cDNA 為模板，采用反轉錄PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 方法對BobERF17 進行擴增。擴增產物進行TA 克隆。對含有BobERF17 的TA 陽性質粒及pCAMBIA3301 表達載體進行NcoⅠ和BstE Ⅱ雙酶切，膠回收酶切后的BobERF17 片段及pCAMBIA3301，二者采用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，測序正確后提取重組質粒，轉化農桿菌LBA4404。

1.7 農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化及轉化株鑒定

將上述構建好的BobERF17 重組過表達載體利用農桿菌介導的浸花法遺傳轉化擬南芥，收獲T0 代種子，經春化后將T0 代種子種于營養土中，待幼苗長至2 片真葉時，噴灑除草劑(10% Basta 稀釋10 000 倍)進行抗性篩選。將篩選獲得的抗性株系進行進一步的分子鑒定，獲得陽性轉化株，對陽性轉化株進行自交純合，T3 代后的純合轉化株系用于后續分析。

1.8 過表達BobERF17 擬南芥株系的表型分析

過表達BobERF17 擬南芥T3 代陽性苗和野生型種子同時播種于滅菌營養土中，并置于相同生長條件，觀察分析兩者的表型差異。選取生長4 周的過表達BobERF17 擬南芥株系進行干旱、鹽、高/低溫脅迫處理，觀察其表型，并進一步采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析其存活率。

2 結果與分析

2.1 BobERF17 編碼區cDNA 的克隆及序列分析

以花椰菜葉片cDNA 為模板，采用RT-PCR 法對BobERF17 編碼區進行擴增，并對擴增產物進行測序。測序結果顯示BobERF17 編碼區長度為576 bp，預期編碼一個含有191 個氨基酸的蛋白，其與之前轉錄組測序獲得的序列大小一致。進一步序列分析顯示，BobERF17 含有一個保守的AP2 結構域，其與雙子葉植物，特別是與花椰菜同屬的蕓薹屬植物如油菜、白菜等中的ERF17 具有較高的序列相似性，而與水稻、玉米、高粱等單子葉植物中的ERF17 相似性較低(圖1-A、B)。結果表明，BobERF17 與油菜、白菜等雙子葉植物中的ERF17 在進化上具有較近的親緣關系，推測它們可能具有相似的功能，而與單子植物中ERF17 親緣關系較遠。

圖1 不同植物中ERF17 聚類樹(A)及氨基酸序列比對(B)分析Fig.1 Phylogenetic tree (A) and sequence alignment (B) of ERF17 from diverse plants

2.2 BobERF17 在不同脅迫處理條件下的表達特征

采用qRT-PCR 法對BobERF17 在不同逆境脅迫處理條件下的轉錄表達特征進行分析。結果顯示，在干旱脅迫條件下，BobERF17 表達量呈現顯著升高趨勢，在干旱處理8 h 時表達量達到峰值，隨后表達量有所下降，但仍比未處理前高(圖2-A)。與干旱脅迫處理下的表達特征相似，在45℃高溫脅迫處理條件下，BobERF17 表達量呈現顯著升高趨勢，處理4 h 時表達量到達峰值，處理24 h 后植株已嚴重萎蔫，瀕臨死亡，表達量低于處理之前(圖2-B)。與高溫脅迫相比，低溫脅迫并未顯著誘導BobERF17 的表達(圖2-C)。在鹽脅迫條件下，除處理12 h 外BobERF17 的表達與對照(0 h)相比未呈現顯著升高或降低的表達趨勢(圖2-D)。上述結果表明，BobERF17 正向響應干旱及高溫脅迫，而對鹽及低溫脅迫不敏感，暗示BobERF17 在花椰菜干旱及高溫應答中發揮重要作用。

圖2 花椰菜不同脅迫處理下BobERF17 表達特征分析Fig.2 Expression profiles of BobERF17 under different abiotic stresses

2.3 過表達BobERF17 擬南芥株系篩選及分子鑒定

根據載體及BobERF17 序列設計組合引物(35SS:5′AACAGAACTCGCCGTAAAG3′，cauliflower-ERF17-A:5′CCGAACCAACAGTCGGAAGC3′)及檢測BobERF17表達的qRT-PCR 引物(BobERF17at-S:5′CGATGATGA TGAGGACGATG3′； BobERF17at-A:5′AAAATTCCAAA GATGCACCG3′)，分別采用PCR 及qRT-PCR 對轉化株進行進一步的檢測。以轉化株DNA 為模板，利用組合引物進行擴增的結果顯示，在隨機挑取的6 個轉化株中均可以檢測到預期大小的擴增條帶，證明含有BobERF17 的表達載體已成功整合到擬南芥基因組中(圖3-A)。以轉化株RNA 反轉錄的cDNA 為模板，利用上述BobERF17at-S/A 引物進行qRT-PCR 分析。結果證實，BobERF17 在擬南芥轉化株中呈現高表達(圖3-B)。上述結果表明，BobERF17 已成功轉入擬南芥，并且在轉化株中呈現高表達。

圖3 BobERF17 過表達轉基因擬南芥陽性株的分子鑒定Fig.3 Identification of overexpressed BobERF17 transgenic lines in Arabidopsis

2.4 過表達BobERF17 擬南芥株系干旱脅迫分析

對過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系進行自交，獲得純合的T3 代株系。將生長4 周的過表達BobERF17 轉基因擬南芥純合株系及野生型對照，在一次性澆足水后不再澆水進行干旱脅迫處理。結果表明，在干旱處理4 d 左右BobERF17 過表達擬南芥株系與野生型的生長表型開始出現差異，轉基因植株整體生長情況優于對照(圖4-A)。隨著干旱處理時間的延長，在干旱處理12 d 后，轉基因植株生長未受明顯影響，而野生型對照葉片呈現泛黃、萎蔫等干旱脅迫癥狀。當干旱脅迫處理24 d，野生型對照葉片明顯萎縮，生長受到嚴重抑制，而過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系盡管葉片也表現出一定程度的萎縮，但植株整體生長勢顯著強于對照(圖4-A)。經干旱24 d 后對所有植株進行復水并統計其存活率，結果顯示過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系的存活率顯著高于野生型對照(圖4-B)。上述結果表明，在擬南芥中過表達BobERF17 可顯著提高轉化株對干旱的脅迫耐受。

圖4 干旱脅迫下過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系表型(A)及存活率(B)分析Fig.4 Phenotypes (A) and survival rate (B) of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under drought stress

2.5 過表達BobERF17 擬南芥株系高溫脅迫分析

為進一步探究BobERF17 在高溫脅迫應答中的功能，對生長4 周的過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系及野生型對照置于光照培養箱中進行45℃高溫處理，并對其在處理0、12、24 h 及正常溫度(22℃)恢復生長2 d 后的表型進行觀察。結果顯示，在高溫處理12 h 后，過表達BobERF17 轉基因擬南芥和對照葉片均表現出一定程度的卷曲、皺縮，二者差異不明顯。但在處理24 h 后，野生型擬南芥表現為葉片嚴重干枯及皺縮現象，而BobERF17 過表達轉化株系葉片雖然也呈現進一步的皺縮，但皺縮程度低于野生型對照(圖5-A)。并且在將所有植株恢復至正常溫度生長后，過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系呈現較高的存活率而對照組大部分已死亡，無法繼續生長(圖5-B)。結果表明，在擬南芥中過表達BobERF17 不但可以顯著提高轉化株對干旱脅迫的耐受，也可以提高其對高溫脅迫的耐受。

圖5 高溫脅迫下過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系表型(A)及存活率(B)分析Fig.5 Phenotypes (A) and survival rate (B) of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under high temperature stress

2.6 過表達BobERF17 擬南芥株系鹽及低溫脅迫分析

為進一步探究BobERF17 在鹽及低溫脅迫中的功能，分別對過表達BobERF17 轉基因擬南芥株系及野生型對照采用200 mmol·L－1的NaCl 和－15℃進行鹽和低溫脅迫處理。在鹽脅迫處理25 d 后恢復正常澆水，并統計后期植株存活率。結果表明，過表達BobERF17并未顯著提高轉化株在鹽脅迫下的存活率(圖6－A)。與之相似，在低溫處理90 min 后將所有株系重新置于22℃的正常生長溫度，并統計其后期存活率。結果表明，BobERF17 轉基因擬南芥株系和野生型對照呈現相似的低溫凍害表型特征，二者存活率無顯著差異(圖6－B)。上述結果表明，在擬南芥中過表達BobERF17 并未顯著提高轉化株對鹽及低溫的耐受水平。

圖6 鹽(A)及低溫(B)脅迫處理下BobERF17過表達轉基因擬南芥株系存活率統計分析Fig.6 Survival rate of overexpressed BobERF17 transgenic Arabidopsis under salt (A) and low temperature (B) stresses

3 討論

在長期的自然選擇下，植物體內形成了復雜的應對逆境脅迫的防御體系[23－24]。一些ERF 家族成員恰好處在植物防御相關信號轉導網絡的交叉點，其通過對下游靶基因的調控發揮在植物逆境脅迫響應的作用。但ERF 家族成員在植物響應不同逆境脅迫中的功能不盡相同。本研究結果表明，花椰菜BobERF17與蕓薹屬植物中的ERF17 序列具有較高同源性，而與單子葉植物的ERF17 親緣關系較遠，暗示BobERF17與蕓薹屬其他植物中的ERF17 可能具有相似的功能。但目前有關蕓薹屬植物中ERF17 的報道較少。因此，對蕓薹屬不同植物中ERF17 進行克隆并探究其在響應逆境脅迫中的作用，對于深入揭示ERF17 在蕓薹屬植物中的分子進化特征及功能具有重要意義。已有研究表明，香蕉中ERF17 參與干旱及冷應激調控[25]。在一氧化氮處理下，落葉松(Larix olgensis)LoERF017對鹽、干旱及ABA 等脅迫均有應答，在擬南芥中過表達LoERF017 可以顯著提高轉化株對干旱及鹽脅迫的耐受[26]。與前人研究結果一致，BobERF17 在干旱脅迫條件呈現顯著上調表達，并且在擬南芥中過表達BobERF17 也可顯著提高轉化株的耐旱性，表明ERF17 轉錄因子在不同植物響應干旱脅迫中發揮重要的正向調控作用。此外，本研究結果證實BobERF17除正向響應干旱脅迫外，其對高溫脅迫也十分敏感，高溫脅迫可以誘導BobERF17 的表達，過表達BobERF17轉基因擬南芥對高溫的耐受性顯著提高，但BobERF17對鹽及低溫脅迫不敏感，推測其可能是在BobERF17基因啟動子區不具有鹽及低溫脅迫響應相關蛋白或調控因子的順式作用元件，使之無法感知鹽及低溫脅迫。并且近幾年的一些報道表明，植物中ERF17 不但參與逆境脅迫應答，還被證實在柑橘果實風味調控[27]、蘋果葉綠素的積累[28]等過程中發揮重要作用。上述結果表明，包括BobERF17 在內的植物ERF17 在進化過程中發生了亞功能化，可能具有多重生物學功能，值得進一步深入探究其功能及調控機制。

4 結論

本研究對花椰菜BobERF17 進行了克隆、表達及功能探究。結果表明，BobERF17 與雙子葉植物，特別是蕓薹屬植物中的ERF17 序列具有較高相似性，但與單子葉植物中該轉錄因子序列差異很大。BobERF17在干旱及高溫脅迫條件下均呈現顯著上調表達特征，但對鹽及低溫脅迫響應不敏感。在擬南芥中過表達BobERF17 對轉化株的生長發育無明顯影響，但可以顯著提高轉化株對干旱及高溫脅迫的耐受。