高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定菌渣有機(jī)肥中紅霉素殘留量

謝 芳，易鴛鴦，吳智慧，胡瀟涵，張 琳

(新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，新疆環(huán)境污染監(jiān)控與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，新疆 烏魯木齊 830011)

我國(guó)每年生產(chǎn)的抗生素有70多種，年產(chǎn)量占全世界的70%。按1 t抗生素產(chǎn)生10 t菌渣計(jì)算，每年會(huì)產(chǎn)生200 t菌渣。國(guó)家環(huán)保部將抗生素菌渣列入《國(guó)家危險(xiǎn)廢物名錄》。殘留的抗生素不僅會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，而且對(duì)人體健康造成潛在危害[1-2]，抗生素殘留問題亟待解決。

紅霉素類抗生素通過垃圾填埋場(chǎng)的菌渣滲濾液或者其它方式滲透到環(huán)境土壤中。所以，對(duì)于抗生素菌渣作為肥料施用后在土壤中的殘留量進(jìn)行檢測(cè)是有必要的。目前，測(cè)定抗生素殘留量的方法主要有微生物法、免疫法、光譜法、色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等[3-5]。其中，微生物法測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、誤差較大；免疫法由于會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)等不足，不適用于殘留抗生素的測(cè)定；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有選擇性高、特異性好、靈敏度高[6-7]、分離效率高、能夠直接得到待測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與相對(duì)分子量等特點(diǎn)，可以達(dá)到快速、可靠分析樣品的目的。鑒于此，作者建立HPLC-MS/MS測(cè)定菌渣有機(jī)肥中紅霉素殘留量的新方法，為檢測(cè)抗生素菌渣作為肥料施用后在土壤中的殘留量提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

土壤樣品采集于新疆某制藥企業(yè)試驗(yàn)基地。播種前，農(nóng)田A1地塊、A2地塊分別按每畝500 kg、1 000 kg施入紅霉素菌渣有機(jī)肥，以空間代替時(shí)間序列法采集播種期、出苗期、開花期和成熟期等四個(gè)時(shí)期的土樣，分別選取對(duì)角線5點(diǎn)法采集表土層(0～20 cm)土樣，剔除石頭、植物根系、枯枝落葉等雜質(zhì)后混勻，用四分法保留500 g送至實(shí)驗(yàn)室，于通風(fēng)處風(fēng)干，過20目篩，儲(chǔ)存于密封袋中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CaCl2，天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，上海青析化工科技有限公司；氨水，西隴化工股份有限公司；1，2-二氯乙烷，色譜純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，F(xiàn)isher公司；紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(98%)，色譜純，河北百靈威超精細(xì)材料有限公司；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水。

TSQ-Quantum Access MAX 型高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；ASE-350型加速溶劑萃取儀，美國(guó)DIONEX公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA；AutoEVA-20Plus型全自動(dòng)氮吹濃縮儀，睿科集團(tuán)股份有限公司；TDL-5A型大容量離心機(jī)，湖南星科科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成50 mg·L-1的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光4 ℃冷藏保存；用甲醇逐級(jí)稀釋，得到濃度(μg·L-1)分別為1、10、50、100、500、1 000的系列紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品預(yù)處理

參考專利[8]，并結(jié)合實(shí)際樣品對(duì)預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取土樣1.0 g(精確至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入乙腈-Tris-CaCl2溶液15 mL，充分振蕩1 min后超聲提取30 min，3 800 r·min-1離心5 min，取上清液。重復(fù)操作2次，合并上清液。

將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至5 mL左右，轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯離心管，加入pH值為6的Tris-CaCl2溶液10 mL，充分渦旋振蕩1 min；加入400 μL氨水調(diào)節(jié)pH值為10，加入1 mL甲醇溶液；快速注射1 mL萃取劑1,2-二氯乙烷，充分振蕩30 s，3 800 r·min-1離心5 min，取底層液體；重復(fù)萃取步驟，合并含有目標(biāo)物的1,2-二氯乙烷，氮吹濃縮后用甲醇定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾至液相用樣品瓶中，待測(cè)。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，USA)；流動(dòng)相為0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，采用梯度洗脫(表1)；柱溫30 ℃；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量2 μL。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子噴霧(ESI)離子源；反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)正離子掃描模式；鞘氣和輔助氣為氮?dú)猓慌鲎矚鉃闅鍤猓粐娚潆妷?.5 kV；離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃；掃描寬度0.01；掃描時(shí)間0.02 s。質(zhì)譜掃描參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜掃描參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

首先以甲醇和乙腈溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，甲醇為流動(dòng)相時(shí)基線穩(wěn)定且響應(yīng)值較高，離子化效率和分析靈敏度較乙腈的高。采用0.1%甲酸溶液能改善分析物的色譜峰形，提高分析物的響應(yīng)值，保證高的靈敏度，且峰形尖銳對(duì)稱，無(wú)拖尾和雙頭峰等現(xiàn)象。紅霉素是極性較強(qiáng)化合物，為了色譜峰的分離效果更好，最終確定采用0.1%甲酸-甲醇作為流動(dòng)相，并梯度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)紅霉素結(jié)構(gòu)特征，采用ESI正離子掃描模式。將2 000 μg·L-1紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以5 μL·min-1進(jìn)入離子源，正離子全掃描，找出M+1峰，分別用于轟擊母離子，即可找出3個(gè)較強(qiáng)信號(hào)的子離子，母離子和子離子共同組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，進(jìn)行定性和定量分析。采用自動(dòng)優(yōu)化和手動(dòng)優(yōu)化相結(jié)合的方式對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳質(zhì)譜條件為： ESI離子源；SRM正離子掃描模式；鞘氣和輔助氣為氮?dú)猓慌鲎矚鉃闅鍤猓粐娚潆妷?.5 kV；離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃；掃描寬度0.01；掃描時(shí)間0.02 s。不同濃度紅霉素的總離子流圖見圖1。

圖1 不同濃度紅霉素的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Erythromycin with different concentrations

2.3 線性范圍和檢出限

取系列紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4.1條件進(jìn)樣測(cè)定，以積分面積(y)對(duì)紅霉素質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，擬合得紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖2 紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Erythromycin

由圖2可知，紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7134.43x-64383.6，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限(LOD)，為0.2 ng·L-1。

2.4 精密度和加標(biāo)回收率

取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.4.1條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，進(jìn)樣量為2 μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.98%～3.57%，表明該方法的精密度良好；實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為70.3%～90.7%，RSD低于5.0%(表3)。

表3 精密度和加標(biāo)回收率結(jié)果(n=5)

2.5 紅霉素殘留量檢測(cè)(表4)

由表4可知，紅霉素在大豆和玉米的播種期、開花期、成熟期均未檢出。A1地塊出苗期均未檢出；A2地塊大豆和玉米出苗期的紅霉素殘留量分別為0.3 ng·g-1、0.2 ng·g-1，殘留量非常低。

表4 紅霉素殘留量/(ng·g-1)

3 結(jié)論

對(duì)色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了測(cè)定菌渣有機(jī)肥中紅霉素殘留量的HPLC-MS/MS法。采用該方法檢測(cè)大豆和玉米不同生育期(播種期、出苗期、開花期、成熟期)土壤中紅霉素殘留量，其中A1地塊四個(gè)時(shí)期均未檢出，A2地塊大豆和玉米出苗期均有檢出，紅霉素殘留量分別為0.3 ng·g-1和0.2 ng·g-1。該方法準(zhǔn)確、靈敏，可用于菌渣有機(jī)肥中紅霉素殘留量的測(cè)定。