一株木質素降解細菌的篩選及其降解途徑

王晶，倪金熒，王利群，卿青，嚴生虎，張躍

（常州大學藥學院，江蘇常州 213164）

木質素在自然界中的含量僅次于纖維素，且被認為是生物質能源中極為重要的芳香族資源[1]，豐富的結構和化學性質使其具有較大的潛力轉化成燃料、化學品和精細化學品等高價值產品。但目前木質素產品市場極為有限，主要是低端產品為主，例如分散劑、黏合劑和穩定劑[2]。而在植物的利用過程中，木質素往往是需要被脫除的，例如在造紙制漿的過程中，為了保留住纖維素，通常采用強酸、強堿的方法來脫除木質素，但存在耗量大并且會帶來二次污染[3]。采用生物降解的方法主要優勢有兩方面：一是降低在造紙過程中導致的處理液的高COD 濃度、高色度以及紙漿硬度，減少對環境的污染；二是降低預處理液中木質素的含量，對處理液進行回收利用，提高利用率。Fonseca 等[4]利用Hlebia brevisporaBAFC 633 菌株進行生物打漿的方法來降低木質素含量從而提高紙漿的質量，Chen等[5]利用Novosphingobiumsp.B-7對堿木質素進行降解，在無外加碳源的條件下COD 降解率達34.7%，得到低分子量醇和木質素單體化合物。Joy等[6]通過Achromobactersp.PS1 利用葡萄糖和1%柴油的環境下產生鼠李糖脂并對原油中的脂肪族和芳香族化合物有著不同程度的降解。已公開的文獻對生物降解木質素研究較多，但對復雜環境下的含木質素廢水的研究較少。所以尋求降解木質素的菌株以及探究真實木質素廢水的降解機制有著重要意義。

本研究從自然界中分離得到了一株木質素降解菌株CCZU-WJ6，通過形態學觀察和16SrDNA序列分析進行菌種鑒定，測定其對秸稈預處理廢液COD 的去除率以及木質素的降解率，通過FTIR 和GC-MS 分析廢液中可溶性木質素處理前后的結構變化和降解產物，根據已知酶和相關文獻推測預處理廢水中木質素降解途徑，為木質素的處理及利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 培養基

初篩固體培養基（木質素培養液）：堿性木質素2g/L，硫酸銨1.33g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鈉0.2g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

復篩苯胺藍脫色固體培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉10g/L，苯胺藍0.08g/L，pH7.0。

富集培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0。

1.2 秸稈預處理廢水

采用堿性鹽氧化法，在高溫高壓間歇反應釜中添加玉米秸稈和18%(g/mL)的磷酸鈉溶液，反應溫度140℃、處理時間60min、氧氣壓力1MPa。處理后真空過濾并稀釋10倍得到預處理液。

1.3 木質素降解菌株的篩選

初篩：將5g 腐爛的木頭放入100mL 富集培養基中，37℃，180r/min 富集培養72h，用無菌水進行梯度稀釋，涂布于初篩固體培養基上，37℃培養48h，挑取生長良好、不同形態和顏色的菌落，通過反復劃線進行分離純化。

復篩：接種于苯胺藍固體培養基上，37℃下培養24h，觀察培養基上是否發生顏色變化。

富集培養基：用滅過菌的接種環挑取復篩固體培養基中發生顏色變化的菌落于富集培養基中，37℃下180r/min 搖床振蕩培養48h， 取菌液10000r/min 離心10min，以500mg/L 的量將沉淀用于處理秸稈預處理廢水。

1.4 菌株16S rDNA基因序列

16S rDNA序列測定由上海生工生物工程完成，將測得的序列與GeneBank中的16S rDNA序列進行同源性比對。

1.5 菌株在廢水中的降解特性

1.5.1 菌株的生長及廢水COD的測定

菌密度以培養液在OD600處的吸光度值來表示，廢水COD的測定采用重鉻酸鉀法[7]。

1.5.2 菌株對木質素降解率的測定

木質素濃度根據280nm吸光度值與木質素濃度標準曲線進行測定[8]，處理n天后木質素降解率（%）=(A0-An)/A0×100%，A0為接菌前培養基中木質素的濃度，An為接菌培養n天后培養基中木質素的濃度。

紫外光譜分析參照菌株的生長及廢水COD 的測定結果，確定取樣時間點，將未接菌的廢液（空白對照）和接菌CCZU-WJ6 培養相應天數的廢液，12000r/min 離心10min，稀釋后的溶液在紫外分光光度計上進行全波段掃描。根據紫外光譜對木質素降解情況進行初步分析。

1.6 菌株酶活測定

每隔24h 從接種4%細菌CCZU-WJ6 的木質素培養液（2g/L） 中取樣1mL，10000r/min 離心10min 后取上清，0.45μm 微孔膜過濾后得到粗酶液，4℃冰箱保存備用。木質素過氧化物酶（Lip）活性的測定采用藜蘆醇氧化法[9]，測定波長為310nm。錳過氧化物酶（Mnp）活性的測定采用Mn2+氧化法[9]，測定波長為290nm。

1.7 廢水中有機物分析

采用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）檢測廢水處理前后化合物結構的變化。取50mL 未接菌的廢液（空白對照）和接菌CCZU-WJ6培養6天后的廢液，12000r/min 離心10min，將上清液放入真空冷凍干燥儀中干燥至恒重，精確稱取1mg冷凍干燥后的樣品和0.1g的KBr在瑪瑙研缽中磨成細粉末混合均勻。在30MPa 的壓力下將細粉末壓制成均勻薄片，進行FTIR掃描，以純KBr薄片為背景樣品，掃描波數范圍為4000～400cm-1。

通過氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析廢水處理前后有機物的變化。同1.5 節方法處理樣品，將pH 調至2.0。使用已經報道的方法萃取、干燥、衍生化處理提取有機物并對有機提取物進行GCMS 分析[10]，最后將氣相色譜中檢測到的各物質的保留時間和質譜圖與美國標準質譜數據庫（NIST）進行比對。

2 結果與分析

2.1 木質素降解菌株的篩選與鑒定

通過分離純化，篩選到了10 株降解木質素的菌株，選取其中對廢水COD 降解率最高的菌株CCZU-WJ6作為后續研究對象。菌株CCZU-WJ6在堿性木質素固體培養基上37℃培養48h后，菌落單一、無色透明、圓形、較為濕潤、輕微隆起。革蘭染色顯示陰性，桿狀，不產芽孢，菌株能使苯胺藍染色劑褪色。

將菌株16S rDNA 序列與Genebank 中報道的16S rDNA 序列進行同源性比對，結果顯示與無色桿菌屬（Achromobacter sp.）相似度達99%以上。采用MEGA5.1 軟件構建系統進化樹（圖1），結合菌落形態，初步確定為Achromobactersp.，命名為Achromobactersp.CCZU-WJ6。

圖1 菌株CCZU-WJ6的系統進化樹

2.2 不同條件對菌株CCZU-WJ6降解性能的影響

采用單因素實驗考察降解條件對菌株CCZUWJ6 降解性能的影響，基礎條件為培養溫度28℃、預處理液稀釋10倍、pH 7.0、菌株接種量0.7mg/L。由圖2(a)可知，菌株對預處理液的降解能力受pH的影響較為顯著，pH 6～8 為較合適的范圍，pH 為7 時COD 去除率最高，達41.3%。圖2(b)顯示，菌株對預處理液的降解能力隨溫度的變化而變化，25～35℃為較合適的溫度范圍，溫度過高或過低都可能抑制細胞內酶活性而使COD 去除率下降。玉米秸稈的堿法預處理液中鹽含量高達18%，高鹽濃度改變細胞內外滲透壓，破壞胞內生化反應進程，抑制細菌生長代謝。圖2(c)為預處理液稀釋倍數對COD 去除率的影響。隨著稀釋倍數的增加，體系中鹽濃度下降，COD 去除率逐漸增大，當稀釋倍數為10 時COD 去除率最高，達41.2%。稀釋倍數繼續增加，COD 去除率逐漸下降，可能是因為體系內營養成分含量太低，影響了菌的活性。圖2(d)為菌體接種量對COD去除率的影響。隨著接種量的增加，COD 去除率不斷提高，當接種量為0.5mg/L時達到最大值，隨后有所下降。

圖2 不同條件對菌株CCZU-WJ6降解性能的影響

2.3 酶活的測定

為研究菌株降解木質素的機理，本實驗對菌株所產胞外酶活性進行檢測。圖3為該菌在木質素培養液中分泌兩種胞外酶的能力。木質素過氧化物酶（Lip）活性在培養24h 時達到最大，為215.5U/L，隨后活性不斷降低；錳過氧化物酶（Mnp）活性在培養48h時達到最大，為200.1U/L，隨后隨著活菌數的減少，酶活性逐漸降低；至第6天時兩種酶的活性均接近于0。該菌在培養后期活菌數下降，是由于細菌的自然凋亡，同時推測降解產物中出現不利于菌體生長的化合物，如苯甲酸和β-香豆酸[11]，對細菌細胞具有一定毒性。

圖3 CCZU-WJ6在木質素培養液中的酶活

2.4 預處理液中細菌的生長及COD的去除

以2.2 節中獲得的優化條件對預處理液進行處理，由圖4 可知，在處理的前4 天內菌體生長較快，第4天時OD600達到最大值0.69，之后生長進入穩定期。與之對應，預處理液的COD在前4天內下降速度最快，隨后減緩，第6天時COD達到最低值34.61g/L，降解率為40.9%；在隨后的3 天里COD值出現上升，推測可能是由菌的死亡造成的。與圖4中OD600的曲線相比，菌株在木質素培養液和預處理液中的生長呈現不同的過程，主要是預處理液中成分較為復雜，可供利用的碳源較多，對菌體的生長提供了較好的營養條件。

2.5 預處理液中木質素的降解率

采用紫外光譜法分析預處理液中木質素的降解率。根據圖4中COD降解曲線，確定處理時間為6天。

圖4 CCZU-WJ6在預處理液中的生長曲線和COD降解曲線

預處理液在280nm 處有紫外吸收峰（圖5），這一紫外吸收波長與堿性木質素的紫外吸收波長一致，經過6天處理后，預處理液在280nm處的紫外吸收峰值減弱，通過木質素標準曲線（y=0.0518+15.55x，R2=0.996）計算預處理液中木質素的降解率為32.1%。

圖5 預處理液全波段掃描圖

2.6 木質素降解途徑的推測

采用GC-MS 對菌處理的預處理液中木質素降解產物進行分析，分別于0 天、3 天和6 天進行取樣，結果見表1。未用菌處理的預處理液中含有三苯基磷、三苯基磷胺和三苯基氧化磷，處理后這類物質消失并檢測出愈創木酚和對香豆酸。

表1 GC-MS產物分析

秸稈預處理液中含有木糖、木寡糖、堿溶性木質素等有機物，其中可溶性木質素在總碳源中含量高達95%。木質素在微生物酶的作用下解聚，采用FTIR 分析可有效觀察到微生物處理前后預處理液中有機物化學鍵的變化[12]。圖6 中2960cm-1與2850cm-1附近—CH3、—CH2伸縮振動峰減弱，可能是處理過程中苯丙烷結構單體之間的C—C 鍵和C—O—C鍵發生氧化斷裂。3440～3420cm-1處吸收峰的減弱推測也存在A2的降解導致N—H伸縮振動的減弱。1000～1500cm-1處振動減弱，可能是A3 結構式中P＝O 鍵的發生斷裂。1080cm-1處的C—O—C反對稱伸縮振動減弱，證明木質素中的醇類、酚類或醚類結構發生了改變。1600cm-1左右C＝O 伸縮振動減弱以及苯環發生骨架振動，由此可推斷在處理過程中產生了新的苯環以及醛酮羧酸類物質。在處理過程預處理液的色度降低，推測可能是CCZU-WJ6通過某種方式作用于木質素的苯環結構以及側鏈，從而導致包括羰基、烯基和苯環等不飽和化學鍵發生了斷裂。

圖6 預處理液紅外圖譜

根據GC-MS 檢測到的兩種小分子化合物和預處理液紅外圖譜，推測處理過程中存在阿魏酸和β-芳基醚代謝途徑，如圖7所示。預處理液中可能存在對香豆酸片段，在酶催化作用下裂解成單環芳香族化合物對香豆酸（B2），圖6所顯示的C—C鍵和C—O—C鍵的斷裂證實了猜想。結合Zhu等[13]關于細菌降解堿性木質素的相關酶的研究，推測對香豆酸會在相關酶的作用下轉化成對羥基苯甲醛，然后在脫氫酶作用下生成對羥基苯甲酸。對羥基苯甲酸在脫羧酶的作用下生成苯酚，通過苯酚代謝途徑在酶的作用下生成兒茶酚并在相關酶的作用下發生開環反應進入三羧酸循環。預處理液中可能存β-芳基醚片段，在Lip 的催化側鏈Cα—Cβ鍵斷開，然后在脫氫酶等芳醚酶的作用下轉化為愈創木酚（B1）等小分子化合物，這體現在1600cm-1處C＝O伸縮振動減弱生成新苯環類物質，然后通過β-酮己二酸途徑進入三羧酸循環。

GC-MS分析結果還顯示，預處理液用菌處理3天和6天后都能檢測到愈創木酚（B1）和對香豆酸（B2），但處理時間越長，濃度越低。推測作為木質素降解的中間代謝產物，它們的進一步分解是整個代謝途徑中的限速步驟，同時它們對菌體都具有一定毒害作用，進一步降低了菌的降解活性。

圖7 預處理液中木質素的降解途徑推斷

3 結論

（1）從自然界中篩選得到一株能降解木質素的菌株，通過菌落形態觀察和16SrDNA 基因序列分析，初步推斷該菌株為無色桿菌屬，并命名為Achromobactersp.CCZU-WJ6。

（2）研究降解預處理廢水的最佳條件，得到適宜條件為：pH7.0、溫度30℃、稀釋倍數10倍、接菌量0.5g/mL。在此條件下處理預處理液6 天，COD的降解率達40.6%，與此同時對木質素的降解率為31.2%。

（3）通過FTIR和GC-MS對菌處理前后預處理液中化合物結構和組成進行分析，其中木質素苯丙烷結構單體之間的C—C 鍵和C—O—C 鍵可能發生了斷裂并生成了芳香族物質，而降解產物中存在愈創木酚和對香豆酸，推斷降解的途徑可能存在阿魏酸和β-芳基醚代謝途徑，為進一步提高預處理液的產業鏈價值以及研究細菌降解木質素機理打下基礎。