汾酒酒醅發酵過程中真菌群落的變化規律

衛春會，甄 攀，張蘭蘭，任志強，黃治國，鄧 杰,

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032205）

汾酒是清香型白酒的典型代表，汾酒入口綿、落口甜、尾味余香、回味悠長的特色與其采用傳統的地缸固態分離發酵和清蒸二次清工藝有關[1-2]。但是，傳統汾酒開放式的生產方式導致了汾酒發酵過程中微生物極其復雜的變化，微生物來源多種多樣[3]。甄攀等[4]研究了汾酒釀造微生物的來源，發現汾酒酒醅中微生物主要來自于釀造場地的空氣以及生產器具。韓莎等[5]通過可培養技術分析汾酒釀造過程中微生物群落結構，并找出微生物種群與代謝物之間的關系。Xiao Ran等[6]基于核糖體高通量測序分析汾酒發酵過程中的微生物，認為汾酒發酵過程中主要細菌主要是乳桿菌科，真菌主要是酵母科（Saccharomycetaceae）和復膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）。雷振河[7]通過高通量測序手段分析清香型白酒地缸中心與邊緣位置酒醅微生物種群結構差異。王雪山等[8]利用高通量測序技術分析不同層次清香型白酒酒醅中微生物種群結構及演替規律，共檢測到161 個細菌屬和161 個真菌屬，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）、畢赤酵母屬（Pichia）和假絲酵母屬（Candida）是酒醅中的絕對優勢微生物。不同層次酒醅微生物多樣性變化規律不同，而且微生物種群結構及演替規律存在明顯差異。目前，國內對清香型白酒釀造微生態的研究多數是針對發酵過程中酒醅微生物種群演替。不同階段酒醅微生物存在很大的差異，從而造成了不同層次的白酒風味特征，因此，研究汾酒發酵微生物群落種類和發酵規律，對提高汾酒品質有重要理論支撐作用。

微生物傳統研究方法主要是菌種分離。隨著技術的進步，近幾年開始運用分子生物學方法對微生物進行研究，如變性梯度凝膠電泳技術、單鏈構象多態性、溫度梯度凝膠電泳技術、基因文庫法和熒光原位雜交技術等[9-12]。傳統的菌種分離只能對少數能分離的菌種進行研究，對低頻突變檢出的敏感性不高，周轉時間長、工作量大。相較于此方法，高通量測序技術在微生物群落結構的研究具有明顯的先進性，作用位點不斷增加，從單個基因分析到多基因分析，具有準確定量、讀長長、實時檢測等優勢[13-14]。

高通量測序技術已經運用于多種分子生物學領域[15-16]，但在汾酒釀造微生物研究中鮮有報道[17]。本研究運用高通量測序技術，對汾酒發酵過程中酒醅樣品中的真菌菌落結構進行分析，以求找到發酵過程中的優勢微生物；再結合酒醅營養成分、乙醇和主要香味物質的變化，分析優勢微生物與營養消耗、物質生成之間的關系，建立一套以高通量測序技術為基準的探究汾酒微生物的方法，以期更加全面地解析汾酒發酵過程中真菌群落結構變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅由山西杏花村汾酒廠提供：汾酒發酵過程酒醅材料，“大楂”指第1次發酵，“二楂”指第2次發酵。根據汾酒酒醅發酵過程中關鍵控制點的發酵時間取樣，大楂：入缸材料（D0d）、4 d材料（D4d）、7 d材料（D7d）、10 d材料（D10d）、15 d材料（D15d）、21 d材料（D21d）、出缸材料（D28d）；二楂：入缸材料（D0e）、4 d材料（D4e）、7 d材料（D7e）、10 d材料（D10e）、15 d材料（D15e）、21 d材料（D21e）、出缸材料（D28e），選取材料為同一生產班組的同一批次材料，取樣時選取地缸中心部位樣品。

Premix ExTaqTMHot Start Version、DL2000 DNA Marker寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K 德國Merck公司；溶菌酶 美國Sigma公司；瓊脂糖、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 美國Solarbio公司；引物由上海英濰捷基生物技術公司合成。

1.2 儀器與設備

水平電泳儀、凝膠成像分析系統、Thermal Cycler S1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；X1R高速冷凍離心機、酶標儀 美國Thermo公司；MX-S型可調式混勻儀 美國賽洛捷克公司；L96G梯度型PCR儀 杭州朗基科學儀器有限公司；Illumina MiSeq PE300 美國Illumina公司；7890A-5975B氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、2410高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅的理化分析

水分測定：采用熱干燥法，取10 g酒醅在120 ℃干燥至質量恒定。

淀粉、乙醇、葡萄糖和麥芽糖測定：采用液相色譜法，準確稱取50 g酒醅，用100 mL蒸餾水充分浸泡，過濾，取清液，然后色譜檢測，流動相：0.002 mol/L H2SO4溶液；色譜柱：離子交換柱；檢測器：示差檢測器。

代謝產物檢測：采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法，準確稱取50 g酒醅，用100 mL 60%乙醇溶液充分浸泡，過濾，取清液檢測。色譜條件：進樣口溫度為230 ℃，載氣He（99.999%）；恒流1.0 mL/min，分流比50∶1，進樣量1 μL；采用程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至155 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。質譜條件：離子源溫度為230 ℃，電離方式為電子電離源，電子能量為70 eV，掃描質量范圍為20～500 u，溶劑延遲3 min。

理化分析利用Excel軟件對數據進行整理，然后利用Origin 8作圖。

1.3.2 真菌群落結構分析

酒醅總DNA的提取：十六烷基三甲基溴化銨法[5]，將提取的DNA加適量含10 ng/μL RNase的100 μL超純水溶解，37 ℃孵育1 h，分裝兩管，置于－20 ℃保存備用。

真菌通用ITS1FI2（5’-GAA CCW GCG GAR GGA TCA-3’）和ITS2（5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’）用于真菌ITS序列的擴增，序列長度205 bp。PCR擴增體系為：模板DNA 100 ng，引物1和引物2各2.5 μL，Premix ExTaqTMHot Start Version12.5 μL，加ddH2O補至25 μL。PCR程序：98 ℃預變性10 s后進行33 個循環，每個循環包括98 ℃變性10 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s；最后一次循環72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[18-19]。

高通量測序：應用Illumina MiSeq PE300分析平臺，得到的原始圖像數據文件，并經堿基識別分析轉化為原始測序序列[20]。

數據分析：對原始測序序列進行過濾、雙端拼接，得到優化序列（Tags），將優化序列在97%的相似性水平下進行聚類，劃分可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并根據OTU的序列組成得到其物種分類[21]。利用Qiime軟件和Mothur軟件[22]進行微生物群落測序數據分析，對測序數據進行總體分析后，再利用Silva[23]數據庫進行16S rRNA基因序列的比對，獲得OTU分類，確定序列對應微生物的分類學地位和多樣性分析，同時利用R語言進行樣品間的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）及作圖[21,24]，利用Canoco5進行微生物多樣性分析中物種與環境因子相關性分析（redundancy analysis/canonical correspondence analysis，RDA/CCA）及作圖[25-26]。

2 結果與分析

2.1 汾酒酒醅中物質的消長規律

汾酒酒醅入缸發酵過程是一個在微生物作用下物質消長的過程，在這個過程中主要的營養消耗物有淀粉、還原糖、葡萄糖和麥芽糖。酒醅中的淀粉、糊精和糖類是釀酒所需要的主要碳源，酒醅中的淀粉被轉化為葡萄糖、麥芽糖等還原糖類物質，還原糖類是微生物直接利用的碳源，可以通過糖酵解途徑生成丙酮酸，然后進行發酵生成乙醇。水分是細胞的重要組成部分，也是汾酒固態發酵酒醅的主要控制指標之一；根據真菌主要作用產生的酒類主要成分有乙醇、乙酸乙酯和高級醇等，乙醇是酒醅發酵的主要產物，生成量是鑒定酒醅質量的主要指標，也是判斷發酵是否正常的重要數據，乙酸乙酯是汾酒中的主要香味物質之一，汾酒中的高級醇主要包括正丙醇、正戊醇、異丁醇和丁二醇等。檢測汾酒酒醅中的物質變化反映發酵過程的進展，也反映微生物檢測時間點的物質基礎。

由圖1可見，發酵過程中，大楂酒醅在4～10 d水分含量快速上升，后水分含量穩定，二楂酒醅0～4 d水分含量增加明顯，后緩慢上升。大楂酒醅的初始淀粉質量分數為30%左右，在4～10 d之間淀粉含量迅速下降，10 d后緩慢下降，第28天大楂酒醅淀粉為13%，大楂階段利用淀粉17%左右；二楂酒醅的初始淀粉為13.5%左右，在0～4 d淀粉含量快速下降，后緩慢下降，第28天二楂酒醅淀粉為8%左右，二楂階段利用淀粉5.5%左右。汾酒大楂發酵過程中，0～4 d酒醅內液化、糖化作用明顯，大量的葡萄糖、麥芽糖生成，4～7 d葡萄糖、麥芽糖含量快速下降，說明微生物在快速消耗還原糖，進行發酵，7 d后，葡萄糖含量緩慢上升，麥芽糖含量較為平穩，汾酒二楂發酵過程中，0～7 d葡萄糖、麥芽糖含量迅速下降，7 d后含量較為穩定，說明大楂發酵的殘余還原糖直接影響了二楂發酵變化規律。

圖1 酒醅中主要營養物質變化規律Fig.1 The changes of main nutrients in fermented grains

由圖2可見，在汾酒大楂發酵過程中，4～10 d進入乙醇主發酵期，含量迅速增加，后緩慢上升，說明4～10 d為酒醅產生乙醇的最重要時期，汾酒二楂發酵過程，入缸就進入快速發酵階段，在0～4 d，乙醇含量迅速上升，后緩慢上升。乙酸乙酯在大楂發酵中，隨著時間的延長，含量從無到有逐步上升，7 d后上升速率有所增加，第28天時能達到75 mg/100 g左右，二楂開始階段乙酸乙酯產生速率較快，中期放緩，后期略有下降，第28天時能達到38 mg/100 g左右。高級醇的變化較為相似，都是在發酵前期產生速率較快，后期基本趨于平穩，在發酵10 d之后基本趨于穩定，二楂酒醅中高級醇含量達到35 mg/100 g左右，大楂酒醅中高級醇含量達到30 mg/100 g左右，二楂中的高級醇含量明顯高于大楂，這是二楂酒醅產出的酒質不如大楂的重要原因之一。

圖2 酒醅中微生物主要代謝物質變化規律Fig.2 Changes of main microbial metabolites in fermented grains

酒醅中的淀粉包括糊精和糖類，在大楂酒醅發酵的0～4 d中，淀粉相對穩定，糖類（葡萄糖和麥芽糖）有明顯的增加，這可能是淀粉轉化為糖的過程，這也是酒醅形成一個營養穩態的時期（有利于后期被利用），而7～10 d酒醅中淀粉、糖類含量迅速下降，這時乙醇含量明顯增加，這是汾酒大楂酒醅乙醇發酵的主要時期；對于二楂酒醅，由于僅在大楂酒醅蒸餾酒后加入大曲然后進行入缸發酵，酒醅中的揮發性物質流出，而其余環境基本不變，酒醅入缸后迅速進入發酵期，但由于后期營養條件的限制，發酵放緩。綜合可以看出，大楂相較于二楂進入發酵期稍晚，造成這樣的原因可能是酒醅條件的差異。同時，大楂比二楂物質利用更高，產生乙醇和乙酸乙酯也較高，說明在這些物質產生階段主要作用微生物比例也較高。

2.2 酒醅中真菌群落結構分析

14 個酒醅樣品，經過過濾、拼接后共產生1 131 292 條Tags，平均每個樣品產生80 852 條Tags，最多129 661 條Tags，最少36 942 條Tags。在97%的相似度水平下對Tags進行OTU劃分后，基于Silva數據庫對OTU進行分類學物種注釋。酒醅樣品Tags聚類共獲得98 個真菌OTU，其中大楂98 個OTU，二楂93 個OTU。采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們代表OTU數目構建曲線，即稀釋性曲線[27-28]。當曲線趨向平坦時，說明測序數量合理，更多的數據量對于發現新的OTU貢獻很小，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU[29]。因此，通過作稀釋性曲線（圖3），對測序深度評估。

圖3 稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves

為了在物種水平中更少占比出現在others中，在科分類學水平上對酒醅樣品真菌物種組成及相對豐度進行統計分析，得到各樣品中真菌科水平的分布情況（圖4），在屬水平對最優勢的各屬進行了統計分析（圖5）。酒醅樣本總共檢測到29 個科的真菌，其中，大楂酒醅樣品中Incertae_sedis、Saccharomycetaceae、Mucoraceae與Lichtheimiaceae是優勢菌科，共占已知菌科的90.0%。二楂酒醅樣品中Incertae_sedis、Pichiaceae、Saccharomycetaceae、Rhizopodaceae與Lichtheimiaceae是優勢菌科，共占已知菌科的94.6%。而相對豐度最高的Incertae_sedis在大楂發酵時期，從0 d占比11.0%，至7 d上升至88.8%，后下降至50%左右，在二楂發酵時期，從0 d占比29.7%，至7 d上升至90.7%，后穩定在90%以上（除D21e為60%左右），說明該科真菌在二楂發酵時的生長繁殖速度明顯高于大楂發酵時期。從二楂的樣品中可以看出Candida隨著發酵的推進，占比逐漸增加，到第15天樣品的時期達到最高（94%），在后期發酵中略有下降；Pichia在發酵開始的樣品中比例達到60%以上，隨著發酵的推進，占比下降。從大楂樣品中可以看出，Candida和酵母屬（Saccharomycessp.）的占比呈現先上升后下降最后趨于穩定的態勢，Candida在7 d占比最高，達到87%，Saccharomycessp.在4 d占比最高，達到41%，Pichia在大楂樣品中隨著發酵的推進占比逐漸下降，釀酒酵母（S.cerevisiae）在大楂樣品中隨著發酵的推進占比呈現先上升后下降的趨勢。說明大楂酒醅發酵過程的主要優勢菌為Candida、Saccharomycessp.、Pichia和S.cerevisiae，二楂酒醅發酵過程的主要優勢菌為Candida和Pichia。

圖4 大楂（A）和二楂（B）真菌結構及分布規律Fig.4 Fungal community structure and distribution in primary (A) and secondary (B) fermentation

圖5 酵母的分布規律Fig.5 Yeast community structure and distribution

酵母是所有樣品中的主要微生物，最少的70%，也是兩個發酵過程差異性最大的微生物群體。發酵初期大楂樣品和二楂樣品的酵母結構相似，都是以Pichia為主，Candida其次，S.cerevisiae較少（Saccharomycetaceae包括S.cerevisiae和漢遜酵母（Hanseniaspora），而S.cerevisiae占比更高）；隨著發酵的推進，大楂樣品和二楂樣品的酵母結構出現了較大的差異性，隨著發酵的推進大楂樣品中的Candida和S.cerevisiae均有所上升，在大楂發酵后期S.cerevisiae比例不低于20%，而二楂樣品中Candida是主要優勢菌，占比均超過60%（除21 d外均達到80%以上），S.cerevisiae比例最高的28 d也僅6%左右。綜上可以看出大楂樣品和二楂樣品的酵母結構差異主要是Candida和S.cerevisiae的比例，這也可能是兩楂生產產酒率差異的主要原因。

2.3 酒醅樣品中的物質成分與微生物差異性和關聯性分析

從酒醅樣品中真菌群落結構出發，利用PCoA探究樣品間存在的差異性；酒醅中的淀粉和糖為微生物生長和代謝提供了營養物質，微生物的代謝產物又影響其生存環境[30]，采用RDA/CCA分析探究酒醅中物質成分和微生物的關系。

如圖6所示，大楂和二楂酒醅樣品的真菌群落結構在發酵開始時（D0d和D0e）相似性高，隨著發酵的推進到7 d以后大楂和二楂酒醅樣品中的真菌群落結構在發酵開始出現較大的差異性。發酵過程中二楂酒醅樣品的真菌群落結構與大楂7 d樣品（D7d）真菌群落結構較為相似，大楂酒醅從發酵第10天（D10d）以后的樣品真菌群落較為相似。如圖7所示，大楂酒醅樣品的真菌群落結構，4、10、21 d材料相似性高，0、7、15 d材料相似性低。而二楂酒醅樣品的真菌群落結構，7、10、15、28 d材料相似性高，0、4、21 d材料相似性低。也就是說，汾酒發酵過程中，大楂和二楂真菌群落在發酵中后期有較大的差異性，其各自真菌群落在發酵中后期相對較為穩定。

圖6 酒醅樣品的PCoAFig.6 PCoA plot for similarity in fungal community structure in fermented grains

將群落結構信息作決策曲線分析，軸中梯度最長為2.43，大于1，小于3，選擇對酒醅真菌菌落和酒醅中物質成分作RDA（圖7），其分析結果蒙特卡洛檢驗值P值為0.10，PC1為56.7%，PC2為36.3%，二維成分占比達到93%。8 個物質因子（水分、葡萄糖、淀粉、麥芽糖、乙醇、高級醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯）全部用于進行關聯性分析。

圖7 酒醅中物質成分與真菌群落的關聯性Fig.7 RDA analysis of correlation between fungal community structure and nutrients in fermented grains

通過酒醅中物質成分與真菌群落主要微生物的RDA結果可以看出，RDA樣品真菌菌落的聚類與PCoA一致。3 個影響最大的微生物是S.cerevisiae、Pichia、Candida，影響大楂酒醅發酵后期最主要微生物是S.cerevisiae，影響二楂酒醅發酵最主要微生物是Candida，Pichia是發酵初期酒醅最主要微生物。發酵初期和大楂發酵后期酒醅中的營養物質（淀粉、葡萄糖和麥芽糖）和真菌群落結構呈正相關，說明營養越充分有利于該階段真菌群落生長。而二楂酒醅中真菌群落與營養物質呈負相關，與高級醇和水分等物質呈正相關，這種相關性說明二楂酒醅中的物質成分（營養的缺乏）決定了其真菌群落結構與大楂的差異性。高級醇和乳酸乙酯含量與Candida有較強的正相關，乙酸乙酯和乙醇含量與S.cerevisiae呈正相關。

3 結論與討論

本研究采用Illumina MiSeq測序方法，直接從汾酒發酵酒醅樣品中擴增高變區進行測序，避免了采用培養方式研究微生物的多種局限性，客觀還原了汾酒發酵過程中菌群結構及豐度的變化規律，為汾酒微生物應用研究提供了理論支撐。結果表明：在97%的相似度水平下，一共獲得98 個真菌OTU；在科的分類水平下，大楂酒醅樣品中Incertae_sedis、Saccharomycetaceae、Mucoraceae與Lichtheimiaceae是優勢菌科。二楂酒醅樣品中Incertae_sedis、Pichiaceae、Saccharomycetaceae、Rhizopodaceae與Lichtheimiaceae是優勢菌科，三大酵母菌屬（S.cerevisiae、Pichia、Candida）為發酵過程真菌的優勢菌屬；大楂酒醅樣品的真菌多樣性指數呈現先上升后下降的規律，而二楂酒醅樣品的真菌多樣性指數在入缸發酵時最高，隨著發酵的進行，多樣性指數逐步降低；大、二楂樣品真菌群落結構發酵后期存在顯著差異；從物質的消長角度可以看出，大楂酒醅產生乙醇的時期在4～10 d之間，產生酯類從4 d左右到發酵結束，而二楂從發酵開始就進入乙醇和酯類產生時期，在發酵10 d左右物質產生放緩。汾酒的兩楂酒醅發酵過程真菌群落呈現較大差異性，結合酒醅中物質的變化和RDA可以推測這種差異性主要有兩方面的原因：

一是營養物質的差異性。大楂在發酵過程消耗淀粉大約為17%，而二楂酒醅發酵過程僅消耗約5.5%，從糖類的消耗也可以看出大楂酒醅中的葡萄糖和麥芽糖含量在各個時期均高于二楂酒醅，同時大楂酒醅中的葡萄糖含量在整個發酵過程均高于1%，而二楂酒醅在發酵15 d左右葡萄糖就處于最低的水平（0.25%），后期可利用的葡糖糖很少，這些都說明二楂酒醅中的營養條件比酒醅匱乏，二楂中最主要的微生物是Candida（最少為D21e號樣，達到61%），在營養匱乏的情況下以芽生孢子出芽繁殖，孢子伸長形成芽管，不與母體分離，形成較長的假菌絲，能夠克服酒醅營養匱乏，這可能是該類酵母在二楂中高于其他酵母含量的重要原因。Saccharomycetaceae包括S.cerevisiae、Hanseniaspora、有孢圓酵母（Torulaspora）等，該類菌種在營養條件充足情況下有較強的產乙醇和產酯能力，所以該類菌在大楂酒醅中有較高的比例，這有利于酒醅產乙醇和產酯，據報道Hanseniaspora是清香型白酒中乙酸乙酯能力最強的菌種[31]，這可能是大楂乙酸乙酯明顯高于二楂的重要原因。所以酒醅中營養物質的動態變化不僅間接反映乙醇的生成情況和發酵狀況，而且可以特征反映發酵過程中微生物的生命活動狀況，也就是酒醅的環境影響了微生物的群落結構。

二是酒醅環境條件的差異性。在二楂酒醅中酸度高于大楂酒醅，Candida有較強的耐受性，能在極端環境進行生長（微厭氧和高酸度），而Pichia的耐酸性和耐溫能力較低，隨著發酵的進行，酸度和溫度的升高導致Pichia的比例下降，同時由于霉菌的厭氧的耐受性較差，所以在所有的酒醅中霉菌的比例較低。這種營養條件和環境條件的差異性可以下一步進行深入研究，結合微生物變化和工藝條件，可能為汾酒的發酵生產提供更有價值的信息。

大楂酒醅和二楂酒醅入缸后進入乙醇主發酵期有一定的時間差異性，大楂是在發酵4 d后進入乙醇的主發酵期，二楂是在入缸后進入乙醇的主發酵期，這種差異性可能主要是微生物和酒醅環境的影響，大楂酒醅入缸后由于是糊化后的糧食和曲混合，酒醅比較疏松，氧氣含量充足，糖化速度快，底物濃度高，水分、溫度、酸度比較適宜，酵母細胞出芽、裂殖成倍增加，酵母菌迅速達到峰值，通過該時期后迅速進入乙醇的主發酵期，而二楂酒醅是在大楂酒醅蒸餾酒后伴曲直接發酵，酒醅的黏稠度、酸度、水分和大楂初始發酵酒醅完全不同，此環境是對接入的大曲微生物進行篩選，同時環境的還原糖含量較高，有利于微生物利用，酒醅迅速進入乙醇的主發酵期，但是由于營養物質的缺乏，發酵10 d基本趨于平穩，生成的乙醇量僅為大楂酒醅的一半。在乙醇和高級醇的產生時期（大楂4～15 d，二楂0～10 d），Candida含量較高，該菌屬鮮見有高產醇類的報道，關于Candida在汾酒酒醅主發酵期的作用是后期的一個研究點。

本研究解析了汾酒兩楂酒醅發酵過程的真菌群落結構，找到了其差異性和差異的優勢真菌屬，同時推測了真菌群落結構差異原因和酒醅乙醇主發酵期差異性的原因，為汾酒的生產工藝優化和提高生產質量提供基礎數據支撐。