產黃青霉抗真菌幾丁質酶的純化及特性分析

高兆建，丁飛鴻，陳 歡，耿云龍，趙宜峰

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000）

幾丁質，又稱殼多糖，為N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結構多糖[1]，是真菌細胞壁的主要結構部件，也參與組成昆蟲的外骨骼、甲殼類動物的外殼[2]。是世界上第二豐富的生物高分子，它與纖維素具有相似的特性[3-4]，由于其分解非常緩慢，所以容易大量堆積造成環境嚴重污染。

幾丁質酶是一種具有降解幾丁質能力的不同大小的蛋白質，廣泛存在于真菌、節肢動物、人類、植物等生物體內[5-6]，也有從湖泊沉積物中分離得到[7]。因幾丁質酶能將幾丁質水解成N-乙酰葡糖胺[8]，其在幾丁質廢物轉化為藥理活性產物方面有重要應用[2]；另外幾丁質酶生產甲殼素衍生物比用化學方法制備在環境保護方具有顯著優勢；在利用幾丁質降解微生物及其合成的幾丁質酶對植物致病真菌的生物防治方面也越來越受到重視[9]；幾丁質酶在人體炎癥與免疫調節中也有著重要作用，在人類病理學中擔任著新的角色[10-12]。

在自然界中，許多微生物都有產幾丁質酶的能力。這些微生物分布廣泛，一些海灘、海水、鹽堿地、鹽場等都是幾丁質酶產生菌生長的理想場所，不同場所分離出的幾丁質酶也通常帶有不同的生理生化特性，Beltagy等[13]從蘇伊士海灣分離得到的嗜鹽黃曲霉產生的幾丁質酶，具有嗜熱的特性；Ray等[7]報道的從咸水湖泊沉積物中分離得到的幾丁質酶RC1830，具有耐高溫、耐堿性金屬鹽的特征；而報道的耐冷假單胞菌幾丁質酶則具有良好的低溫適應性，在低溫下依舊有較高的酶活力[14]。Patidar等[15]從富含幾丁質的蝦晾曬場土壤中分離到產幾丁質酶的產黃青霉菌株，并對菌株發酵培養基優化，但未見對其幾丁質酶的進一步深入研究。Orwa等[16]從肯尼亞馬加迪湖分離到產黃青霉，其發酵液對多種細菌和真菌有抑制作用，但還未對抑菌物質分離鑒定。目前已有許多關于幾丁質酶的菌種篩選、發酵生產、分離純化和特性的報道，但是這些報道僅限于較少的真菌種類，且這些酶通常在某一特性方面具有優勢，在酶的大規模生產應用方面依然存在成本太高、穩定性差、催化效率低、不能滿足特定需求等缺陷。因此，有必要圍繞酶的應用進一步持續開發新型的具備更好特性的幾丁質酶資源。

在幾丁質酶應用于食品保鮮防腐方面，研究報道有限，菌種資源更顯不足，加之現有幾丁質酶的酶學性質仍不能滿足食品行業應用的需要[17]，也很少涉及其作為食品保鮮劑在食品領域的詳細研究[18]。本研究從產黃青霉Xch23發酵液中分離一種耐高溫的幾丁質酶，與報道的產黃青霉幾丁質酶相比，該幾丁質酶可對多種真菌有顯著抑菌作用。本研究就幾丁質酶的分離純化、酶學性質、抗菌特性方面進行探究，以評價其在食品保鮮防腐中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗室前期從堆積貝殼垃圾處篩選到的1 株產幾丁質酶的產黃青霉（Penicillium chrysogenum）Xch23。

1.1.2 試劑

柱層析填充材料DEAE-Cellulose A52、Sephadex G-100 美國Pharmacia公司；幾丁質、乙二醇幾丁質、乙二醇殼聚糖、α-幾丁質、β-幾丁質 美國Sigma公司；標準蛋白分子質量Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；除另有規定外，其他化學品均屬分析級，從當地購買。

1.1.3 培養基

種子培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基基礎上添加(NH4)2SO41.0 g/L，KH2PO40.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NH4NO30.5 g/L，CaCl20.01 g/L，pH 6.5（121 ℃、20 min高壓滅菌）。

搖瓶發酵培養基：膠體幾丁質5.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NH4NO31 g/L，CaCl20.015 g/L，FeSO40.1 g/L，pH 6.5（121 ℃、20 min高壓滅菌）。

1.2 儀器與設備

AKTA Explorer 100型蛋白質純化系統 美國GE公司；3K30型臺式冷凍離心機 德國Sigma公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Cascada LS型超純水系統 美國Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體幾丁質的制備與幾丁質酶發酵及活力測定

膠體幾丁質的制備參照Homthong等[19]的方法并稍作修改。將100 g幾丁質緩慢加入到1.75 L預冷的濃縮鹽酸中，在磁力攪拌器上輕輕攪拌3 h。再過濾至20 L預冷蒸餾水中并不斷攪拌，待其沉淀出稠密的白色沉淀，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，用冷水反復清洗沉淀直到pH值達到6.0，膠質幾丁質保存4 ℃冰箱備用。

將斜面保藏的產黃青霉Xch23菌株接種于PDA斜面，28 ℃恒溫培養5～7 d。加無菌水洗脫下孢子，按4%的量接種于種子培養基，30 ℃、180 r/min培養3～4 d。再以6%的量接種于液體發酵培養基，30 ℃、180 r/min培養6 d，得到的發酵液過濾后濾液10 000 r/min離心15 min，收集上清液即幾丁質酶（Chi-Pc76）粗酶液。

Chi-Pc76活力的測定參照文獻[20]方法，并稍作修改。0.5 mL適當稀釋的酶溶液與0.5 mL 1 g/100 mL膠體幾丁質（溶于pH 6.0、20 mmol/L磷酸緩沖溶液中）混合，于55 ℃、pH 6.0條件下緩緩振蕩孵育30 min后，向體系中加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸并在沸水中煮沸10 min，然后立即冷卻并于室溫條件下8 000 r/min離心10 min，540 nm波長處測定吸光度。酶活力定義：每分鐘水解幾丁質釋放1 μmol還原糖所需的酶蛋白量。

1.3.2 幾丁質酶Chi-Pc76的分離純化

1.3.2.1 DEAE-Cellulose A52離子交換層析

對制備所得的Chi-Pc76粗酶液用85%的硫酸銨溶液沉淀蛋白，并靜置過夜。8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，使用磷酸緩沖液（20 mmol/L、pH 6.5）溶解沉淀，并透析過夜。將經上述步驟所得酶液上樣于已用磷酸緩沖溶液平衡過的DEAE-Cellulose A52（2.5 cm×40 cm），用含有0～1.0 mol/L NaCl的上述相同緩沖液進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，每管收集3 mL，對每個收集峰測定酶活力。

1.3.2.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析

合并離子交換層析有活性的收集管，經過超濾濃縮后上樣于以20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 6.5）充分平衡過的層析柱（80 cm×1.5 cm），用20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 6.5）洗脫，流速為0.8 mL/min。收集各洗脫管，并測定酶活力。

1.3.2.3 Chi-Pc76分子質量的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）進行分子質量測定。采用4%濃縮膠和12%分離膠。并用考馬斯亮藍R-250在電泳后染色觀察，根據Marker帶和純品條帶遷移率計算其分子質量。

1.3.3 幾丁質酶的酶學性質分析

1.3.3.1 溫度對Chi-Pc76活力的影響

最適溫度測定：在30～90 ℃范圍內測定酶活力，以最高酶活力為100%，確定最適溫度。溫度穩定性：將一定量的Chi-Pc76在30～90 ℃范圍下保溫1 h，快速冷卻至室溫。以未做處理的酶活力為100%，在55 ℃條件下測定殘余酶活力。

1.3.3.2 pH值對Chi-Pc76活力的影響

最適pH值測定：測定Chi-Pc76在55 ℃不同pH值緩沖液中活力，最高酶活力定義為100%，計算各pH值相對酶活力，確定最適反應pH值。pH值穩定性測定：將純化后的Chi-Pc76在4 ℃不同pH值孵育12 h，測定殘余酶活力，將未處理的酶液酶活力定義為100%，計算相對酶活力。

1.3.3.3 金屬離子以及部分化學試劑對Chi-Pc76活力的影響

向反應體系中分別加入不同的金屬離子和化學試劑，于30 ℃孵育1 h，再按照1.3.1節方法測定酶活力，以不加任何以上金屬離子和化學試劑的酶液作對照，分析金屬離子和部分化學試劑對酶活力的影響。

1.3.3.4 Chi-Pc76的底物特異性及動力學參數測定

分別以1 g/100 mL的膠體幾丁質、乙二醇幾丁質、乙二醇殼聚糖、殼聚糖、α-幾丁質、β-幾丁質、可溶性淀粉以及羧甲基纖維素作為反應底物，55 ℃分別反應30 min，測定Chi-Pc76活力。

以不同濃度的底物在pH 6.0、溫度55 ℃條件下測定Chi-Pc76活力，采用雙倒數作圖法計算該條件下酶的米氏常數Km值。底物質量濃度依次為0.0、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、1 mg/mL，以質量濃度的倒數1/S為橫坐標，反應速率的倒數1/V為縱坐標，繪制Chi-Pc76動力學曲線圖并計算Km。

1.3.3.5 Chi-Pc76對真菌抑制活性

采用瓊脂孔擴散法檢測抑菌活性，具體參照Farag等[21]的方法，并稍作改進。用黑曲霉、產黃青霉、尖孢鐮刀菌以及橘青霉孢子制成懸液，使用接種環沾取少量孢子懸液，并點接到各自培養平板中間，培養2 d后，在每個平板上分別用打孔器距離菌落約0.5 cm位置打孔。在平板的1號孔中加入100 μL Chi-Pc76酶液，在2號孔中加入100 μL無菌水，作為對照。將平板28 ℃培養3～5 d后，觀察真菌抑制情況。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 Chi-Pc76的分離純化

2.1.1 DEAE-Cellulose A52離子交換層析

粗酶液DEAE-Cellulose A52離子交換層析見圖1，在層析圖譜中出現了4 個較為明顯的蛋白峰，其中低鹽洗脫（0～0.5 mol/L NaCl）得到1 個峰，高鹽洗脫（0.5～1.0 mol/L NaCl）得到3 個峰。檢測P3峰有幾丁質酶活力，說明Chi-Pc76在pH 6.5緩沖液中帶有較多的負電荷，與離子交換劑結合較強，需要高濃度的NaCl才能將其洗脫下來。合并收集管，測定Chi-Pc76比活力為212.4 U/mg，純化倍數為6.21 倍，回收率為60.5%。

圖1 產黃青霉Xch23產Chi-Pc76 DEAE-Cellulose A52層析Fig.1 Chromatographic separation of Chi-Pc76 from P.chrysogenum Xch23 on DEAE-Cellulose A52

2.1.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析

離子交換層析所得Chi-Pc76酶液Sephadex G-100進一步純化，結果如圖2所示。出現5 個較為明顯的蛋白洗脫峰，其中P4蛋白峰檢測到幾丁質酶活力。合并收集第28～34號管，冷凍干燥后備用。可以看出凝膠過濾層析對Chi-Pc76純化倍數較高，體現出對該酶的高純化效率，適合于Chi-Pc76純化。表1總結了Chi-Pc76各步純化情況，經過3 步純化后，最終酶活力為747.6 U，酶比活力584.8 U/mg，純化倍數17.1 倍，回收率21.6%。國內外已報道了不同來源的幾丁質酶的分離純化，Karthik等[22]通過以二乙氨乙基-丙烯酸甲酯共聚物為介質的離子交換層析和凝膠樹脂層析純化一種酸性幾丁質酶，純化倍數為12.44，酶比活力為161.35 U/mg；Farag等[21]通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析以及離子交換色譜對海洋土曲霉中的幾丁質酶進行分離純化，回收率為12%；Lee等[23]用異丙醇沉淀法和正丁基瓊脂糖柱層析法從培養基中純化幾丁質酶，回收率僅為8.8%。與報道相比，本研究的純化方法和使用的純化介質效果更好，回收率和比活力都較高。

圖2 產黃青霉Xch23產Chi-Pc76 Sephadex G-100層析Fig.2 Chromatographic separation of Chi-Pc76 from P.chrysogenum Xch23 on Sephadex G-100

表1 產黃青霉Xch23 Chi-Pc76純化步驟Table 1Summary of purification steps of Chi-Pc76 from the fermentation broth of P.chrysogenum Xch23

2.1.3 Chi-Pc76分子質量的測定結果

如圖3所示，經過系列純化后得到的樣品電泳顯示單一條帶，表明Chi-Pc76達到電泳純，計算得Chi-Pc76表觀分子質量約為61 kDa，與Patil等[24]報道的赭綠青霉MTCC 517（64 kDa）、Farag等[21]報道的土曲霉（60 kDa）幾丁質酶分子質量類似。但比從嗜鹽黃曲霉（30 kDa）[13]、蠟樣芽孢桿菌IO8（30 kDa）[25]、地衣芽孢桿菌JS（22 kDa）[26]等微生物中分離的幾丁質酶大；而低于Guo等[27]報道的Aeromonas schubertii幾丁質酶（75 kDa）。不同來源的幾丁質酶分子質量差距較大，在細菌、酵母、植物、節肢動物等中發現的幾丁質酶的多數大小在20～90 kDa的范圍[28]。

圖3 純化后產黃青霉Xch23 Chi-Pc76 SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of purified Chi-Pc76 by SDS-PAGE

2.2 Chi-Pc76酶學性質分析

2.2.1 溫度對Chi-Pc76活力的影響

如圖4A所示，在30～55 ℃范圍內，酶活力隨溫度上升而增高，當溫度為55 ℃時，具有最大活力，55 ℃以后酶活力逐漸降低。最適溫度與報道的從嗜鹽黃曲霉中分離得到的嗜熱幾丁質酶[13]60 ℃較為接近，但顯著高于赭綠青霉（40 ℃）[24]、假單胞菌[29]（20 ℃）的幾丁質酶最佳溫度。Chi-Pc76熱穩定性較好（圖4B），65 ℃以前熱穩定性曲線比較平緩，酶活力幾乎保持不變。在65～90 ℃，熱穩定性和酶活力均下降，可能是由于高溫使酶變性失活導致。該酶的熱穩定性同Liu Dong等[30]報道的蘇云金芽孢桿菌、Liang等[31]報道蠟樣芽孢桿菌幾丁質酶類似。

圖4 溫度對Chi-Pc76的作用Fig.4 Effect of temperature on the stability of Chi-Pc76

2.2.2 pH值對Chi-Pc76活力的影響

pH值能顯著影響酶反應速率，其對Chi-Pc76活力的影響如圖5A所示。在pH 3～12時，酶活力呈現先增大后減小的現象。當pH值在3～6時，酶活力顯著上升，并在pH 6時達到最高，與源自玫瑰鏈霉菌[32]、芽孢桿菌[33]、黃單胞菌[34]的幾丁質酶一致。

Chi-Pc76的穩定性在pH 4～10內良好，保留80%以上的酶活力（圖5B）。當pH值大于10時，穩定性隨著pH值的升高而有顯著降低。該酶穩定性范圍與Nguyen等[35]報道的幾丁質酶、Kopparapu等[36]報道的嗜熱擬青霉幾丁質酶穩定性范圍相似。

圖5 pH值對Chi-Pc76的作用Fig.5 Effect of pH on the stability of Chi-Pc76

2.2.3 金屬離子及化學試劑對Chi-Pc76活力的影響

金屬離子能夠與酶形成絡合物，維持或破壞三維結構和構型，在生物催化中起重要作用[22]。不同濃度金屬離子對Chi-Pc76活力影響如表2所示。Ca2+、Ba2+、Mg2+、K+、Na+、Li+、Al3+均對酶起到激活作用；Mn2+、Co2+、Fe2+、Ag2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Pb2+、Ag+對酶活力具有抑制作用。其中Ca2+的激活作用最強，使酶活力達到了156%左右。Ca2+對幾丁質酶的激活作用許多文獻均有報道，其激活作用原因可能是該陽離子在調節酶活力構象中起重要作用，從而增加幾丁質水解活性[2]。Hg2+、Pb2+和Ag+的抑制作用最強，完全抑制酶活力。Hg2+的強抑制作用因為它與蛋白鏈半胱氨酸殘基中的—SH基團發生反應，破壞三級結構，從而使蛋白質失活所致[22]。這一結果與Ray等[7]報道的幾丁質酶性質以及從鏈霉菌中分離得到的幾丁質酶的結果有相似之處[37-38]。真菌幾丁質酶活力通常受Cu2+的抑制[36]在本實驗中也得到驗證。化學試劑中，SDS、Tween 80、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、尿素未見對酶活力的顯著影響。二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對酶活力有抑制作用。此類試劑對酶活力的影響是基于表面活性劑能破壞水介質的表面張力，增加了底物與酶活力位點之間的接觸頻率，從而提高了酶的周轉率[39-40]。酶在1% Tween 80或Triton X-100以及濃度5 mmol/L的PMSF或尿素存在下較為穩定，這可能是因為氨基酸的組成和三維結構支持了酶對疏水/非極性微環境的相對抗性[41]。此外由于PMSF未見對酶活力的抑制，而是有輕微的激活作用，因此在提取過程中還可以利用PMSF控制粗提物的絲氨酸蛋白酶活力，防止下游過程中蛋白質的徹底降解[31]。在存在EDTA情況下，酶活力顯著降低，表明該酶可能為金屬酶，絲氨酸占據了酶的活性位點[42]。DTT和β-巰基乙醇均對該酶強抑制，表明其活性位點可能有巰基的存在[2]，二硫鍵的形成對蛋白質結構的穩定和蛋白質功能的維持至關重要，因此當巰基被破壞，酶蛋白的功能便會喪失。

表2 金屬離子及部分有機試劑對Chi-Pc76活力的影響Table 2 Effect of metal ions and some organic reagents on the activity of Chi-Pc76

2.2.4 底物特異性與Km值的測定結果

如表3所示，Chi-Pc76對膠體幾丁質相對酶活力最高，接著是α-幾丁質（65.87%）、乙二醇幾丁質（55.23%）、β-幾丁質（49.64%），對乙二醇殼聚糖和殼聚糖顯示微量的活性，分別為9.14%和11.36%。對其他所測的底物可溶性淀粉、羧甲基纖維素無活性。整體看，Chi-Pc76對不同結構形式的幾丁質有高的水解活性。與其他報道的幾丁質酶相比，Chi-Pc76顯示出相對嚴格的底物特異性，如Yahiaoui等[2]報道的Paenibacillus timonensis幾丁質酶對膠體幾丁質、乙二醇幾丁質、乙二醇殼聚糖、木聚糖和直鏈淀粉等底物具有高的水解活性。

表3 幾丁質酶Chi-Pc76對不同底物的底物特異性分析Table 3Substrate specificity of Chi-Pc76

根據雙倒數曲線計算可得Chi-Pc76以膠體幾丁質為底物時Km為0.25 mg/mL，Vmax為20 μmol/（min·mg）。Km值為酶的特征常數，反映其與底物親和性，數值越大，則反映該酶與底物親和性較低，數值越小，則反映與底物親和性越高。Cheba等[43]從新型紅海芽孢桿菌中提取的幾丁質酶Km為6.971 mg/mL，從青霉菌中分離純化的幾丁質酶[24]Km為1.3 mg/mL，報道的堿性幾丁質酶[44]Km為4.41 mg/mL，耐熱性幾丁質酶[40]Km為5.6 mg/mL。與這些結果相比，本實驗所研究的幾丁質酶Km值更小，體現出對底物的更高親和性，適合于幾丁質的酶解降解，具有一定的應用價值。

2.2.5 Chi-Pc76對真菌抑制作用

通過測定Chi-Pc76的抗真菌活性，評價Chi-Pc76在食品防腐及生物防治方面的應用價值。如圖6所示，Chi-Pc76對黑曲霉、黃曲霉、尖孢鐮刀菌以及橘青霉都產生了顯著抑制作用。在加入Chi-Pc76的孔1附近真菌生長受到強烈抑制，而空白對照4 種真菌的菌絲生長完全正常，說明Chi-Pc76對供試菌株有抑菌作用。從抑菌強度看，對黃曲霉和黑曲霉抑菌效果強于尖孢鐮刀菌和橘青霉，這可能與不同真菌其細胞壁中的幾丁質含量及結構形式不同有關。抗真菌作用的幾丁質酶已從多種細菌和真菌中分離，比如灰黃曲霉[45]、耐冷假單胞菌[14]、海洋土霉菌[21]等菌株，但所產幾丁質酶抑制真菌的范圍和抑制效果有顯著差異。盡管幾丁質不是所有真菌細胞壁的主要成分，但大多數都在細胞壁中含有幾丁質[46]，故在真菌菌絲快速生長延伸時幾丁質酶通過降解其細胞壁中的幾丁質達到抑制真菌的效果。Chi-Pc76對病源真菌及腐敗真菌顯示出較好的抗菌效果，這將有助于開發食品防腐劑或生物農藥控制病源真菌的生長。

圖6 純化Chi-Pc76對真菌的抑制作用Fig.6 Antifungal activity of Chi-Pc76

3 結 論

本研究從產黃青霉Xch23發酵液中分離純化抗真菌特性的幾丁質酶。通過兩步柱層析技術純化到單一組分的Chi-Pc76，其在較寬的pH值范圍（5.0～8.0）和溫度范圍（45～65 ℃）保持高的催化活性，在pH 4.0～10.0及70 ℃以下Chi-Pc76穩定性好。不同金屬離子對Chi-Pc76有一定影響，Ca2+、Ba2+、K+、Na+對酶有顯著激活作用，Ca2+激活作用最強。Chi-Pc76對表面活性劑SDS、Tween 80和Triton X-100耐受性較好。Chi-Pc76有較廣的底物催化特性，對膠體幾丁質催化活力最高。Chi-Pc76具有抗真菌活性，對黑曲霉、黃曲霉、尖孢鐮刀菌及橘青霉有明顯的抑制作用。綜合Chi-Pc76分子質量、酶學特性及抗真菌性能同已報道的幾丁質酶存在較多差異，推測Chi-Pc76可能是一種新型的幾丁質酶，在食品防腐、生物技術、農業生防及環境保護方面有開發應用前景。