新型植物基載體對乳糖酶的高效遞送及保護

侯欣堯，鄧紫玙,2，梁宏閃,2,，李 斌,2,3

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.湖北省功能食品工程技術研究中心，湖北 武漢 430068）

乳糖是由D-葡萄糖和D-半乳糖在乳糖合成酶的催化下通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖，廣泛存在于牛奶及奶制品中[1-2]。乳糖不能直接被人體吸收，需要被消化道中產生的乳糖酶分解為單糖后才可以被吸收利用。若部分乳糖酶缺乏的人群一次性攝入較多的乳糖，乳糖未被水解進入結腸后，被腸道微生物分解，產生大量的乳酸、甲酸、醋酸等短鏈脂肪酸和甲烷、H2、CO2等氣體，會造成腸道內滲透壓升高使得腸腔內水分增多而引起腹漲、腸鳴、腸絞痛直至發生水瀉等癥狀，該現象被稱為乳糖不耐受[3]。乳糖酶缺乏和乳糖吸收不良在世界范圍內廣泛發生，但存在較大的地理差異，全世界大約有40億 人面臨乳糖不耐受[4]，大部分集中于亞洲人和非洲裔美國人，歐洲乳糖不耐癥患病率低于亞洲[5]。在我國大約有90%以上的成年人有乳糖酶缺乏的現象[6]。乳糖酶的缺乏由遺傳因素決定并隨著年齡的增長，腸道內乳糖酶的活性逐漸降低，導致成年人乳糖不耐癥患病率更高。目前為緩解乳糖不耐受這一問題，已經研發出相關方法，其中包括生產低乳糖或無乳糖制品。但目前有研究表明，乳糖不耐癥患者長期食用無乳糖制品會導致營養不良問題，如鈣、磷元素和維生素的缺乏，骨骼處于亞健康狀態，患骨質疏松的風險更高等[7]，因此將乳糖酶以酶制劑的形式添加到乳制品中是解決乳糖不耐癥最根本最直接的選擇，具有較大的發展潛能。

生物酶制劑安全、無毒，將其用于解決乳糖不耐癥是近年來的一個研究熱點，具有重要的臨床價值和社會意義。乳糖酶于1998年底被我國食品添加劑標準化委員會列入食品添加劑目錄，作為食品原料進行管理。目前有研究發現用乳糖酶治療兒童腹瀉繼發乳糖不耐受能顯著提高臨床療效，縮短治療療程且無明顯不良反應[8]。因此，利用乳糖酶制劑治療兒童腹瀉繼發乳糖不耐受在保證嬰幼兒乳糖攝入的同時緩解乳糖不耐受癥狀，是治療腹瀉繼發乳糖不耐受的理想方法。其中β-半乳糖苷酶是最常見的乳糖酶補充劑，可將其在消費者食用前以液態形式添加到牛奶中，或與乳制品一起以固體形式加入牛奶中[9]。由于單一裸露的乳糖酶在口服時易被胃酸破壞，因此眾多研究者聚焦構造乳糖酶遞送體系，保護其順利通過胃液，抵達腸道發揮作用[10-11]。然而已有研究對乳糖酶在胃液中保護效果欠佳，使其在主要作用部位小腸處活性較低，因此乳糖酶的遞送仍需開發出一種綠色、生物相容性好的有效遞送系統，在滿足安全性的同時實現對乳糖酶的高效保護及靶向遞送。

自然界中，花粉孢粉素外壁具有良好的彈性、物理和化學抗性、紫外線屏蔽能力和抗氧化活性。這些特性使植物能夠保護其遺傳物質不受外界因素影響[12-14]。因此可通過提取孢粉素生產無過敏原外殼，即孢粉素外壁膠囊（sporopollenin exine capsules，SECs）[15]。同時，SECs被美國食品和藥物管理局普遍認為是安全材料[16-17]。近年來，從天然花粉的孢子中提取的SECs由于結構均勻、力學和化學穩定性強、孔隙率大、內腔大、可利用性豐富等特點，被廣泛用于藥物及營養素包封[18]。向日葵花粉外壁比許多其他花粉外壁對酸和堿的處理更有彈性，且該花粉為單腔大孔徑花粉，便于物質負載，是一種優質的遞送材料。根據Rienzo等[19]的研究可知，雖然向日葵花粉外壁表面孔隙大使其便于物質的負載，然而在遞送過程中負載物較易從花粉表面孔中釋放，影響負載物活性或穩定性。針對這一問題，可以通過適宜的聚合物涂層技術進行調控，保護負載物在遞送過程中的穩定性。

海藻酸鈉（sodium alginate，Alg）又稱海藻膠、褐藻酸鈉或海帶膠，是一種從天然褐藻中提取的聚陰離子多糖的鈉鹽，因其無毒同時具有良好的生物黏附性、生物相容性、生物可降解性及膠凝特性，被廣泛用于食品工業、醫藥工業、日用化工業等領域[20]。茯苓多糖（carboxymethylpachymaran，CMP）為茯苓的主要成分，但其水溶性低，影響其研究應用[21]，而經過羧甲基化的CMP其水溶性及生物活性均顯著提高[22]，同時還表現出顯著的免疫調節、抗炎和抗氧化活性[23]。此外，最近的研究表明，CMP具有顯著的pH值敏感性和優異的溶脹能力，因此有很大潛力成為一種新的藥物或營養素載體[24]。

本實驗采用不同Alg與CMP溶液體積比的混合凝膠體系作為包膜材料，對負載乳糖酶的新型植物基材料（向日葵SECs）進行包膜，探究不同多糖比例對乳糖酶的釋放及保護效果，優化最佳配比，以期最大化實現對乳糖酶的保護及控制性釋放。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-半乳糖苷酶 上海源葉生物科技有限公司；向日葵花粉 卡爾科學實驗室；羧甲基CMP 武漢潤歌生物科技有限公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）、Alg國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DZ-3BCII真空干燥箱 上海索普儀器有限公司；JSM-6390LV掃描電子顯微鏡 日本NTC公司；Carl Zeiss LSM880激光共聚焦顯微鏡 德國耶拿公司；Thermo Multskan Go全自動酶標儀 上海鼎謙生物科技有限公司；SPX-150BIII生化培養箱 杭州綠博儀器有限公司；FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YP502N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；MIX-30S渦旋儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花粉SECs的制備及表征

1.3.1.1 SECs的提取

稱取2 g脫脂向日葵花粉加入15 mL 85 g/100 mL磷酸溶液，酸解處理不同時間（3、5、10、20 h）后，真空過濾收集花粉，隨后經過一系列洗脫：熱水（50 ℃，5×100 mL）→熱丙酮（50 ℃，2 h，100 mL）→2 mol/L熱鹽酸（50 ℃，1 h，100 mL）→熱水（50 ℃，5×100 mL）→熱丙酮（50 ℃，1×100 mL）→熱乙醇（50 ℃，2×100 mL），每次洗滌之間至少懸停5 min。真空過濾收集處理后的SECs，在60 ℃烘箱中干燥至質量恒定，放入干燥箱貯存備用。

1.3.1.2 激光共聚焦顯微鏡分析

未脫脂和經脫脂酸解處理的SECs通過激光共聚焦顯微鏡分析其熒光。配備3 個光譜反射/熒光檢測通道，6 條激光線（405、458、488、514、561、633 nm）和1 個倒置顯微鏡。

1.3.1.3 掃描電子顯微鏡觀察

取干燥的樣品用導電膠置于載物臺上，用洗耳球吹去未粘合樣品。經過離子濺射儀噴金后，在10 kV電子下用電子顯微鏡觀察脫脂后向日葵花粉的形貌。

花粉SECs切面制備是通過將SECs固定在掃描電子顯微鏡樣品固定帶上，將其浸入液氮中20～30 s后，使用一把鋼制手術刀片切割而成。

1.3.2 負載實驗

50 mg花粉SECs與1 mL 1 mg/mL乳糖酶溶液渦旋均勻混合10 min，將混合液轉移至6 孔板中，用錫紙覆蓋6 孔板的上端且扎孔。將6 孔板置于30 ℃真空干燥箱真空干燥0.5 h，而后關閉真空閥繼續干燥2.5 h后得到負載樣品。

1.3.3 乳糖酶活力測定

1.3.3.1 磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）配制

稱取8.8 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、250 mg七水硫酸鎂（MgSO4?7H2O）、18.6 mg二水乙二胺四乙酸（C10H14N2Na2O8?2H2O）及8.0 g三水磷酸氫二鉀（K2HPO4?3H2O）溶解于600 mL水中，攪拌至溶液均一穩定。而后用pH計進行測量，誤差在0.05之內。測量完畢后，將溶液轉入1 000 mL容量瓶，用水定容并搖勻，至于4 ℃冷藏貯存。

1.3.3.2 ONPG底物溶液配制

將250.0 mg ONPG溶解于80 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，而后轉移至100 mL容量瓶中，用反應緩沖液定容搖勻，制備不得早于使用前2 h。

1.3.3.3 Na2CO3溶液配制

稱取50 g Na2CO3、37.2 g二水乙二胺四乙酸溶解于約700 mL的超純水中，緩慢攪拌至固體完全溶解。最后定容至1 000 mL的容量瓶中，搖勻。可放至室溫密封貯存。

1.3.3.4 酶活力測定

配制1.00 mg/mL乳糖酶溶液作為對照組母液。每個樣品取兩支試管，一支作為實驗組，一支作為對照組。將所有試管、ONPG底物溶液和Na2CO3溶液同時放置于37.0 ℃水浴鍋中平衡30 min，而后取出放在試管架中，按照已定的順序排好。在樣品液中快速加入5.00 mL ONPG底物溶液，在對照液中加入2.00 mL Na2CO3溶液，渦旋混合均勻。室溫下靜置，精確反應10 min。迅速加入2.00 mL Na2CO3溶液于樣品液中，5.00 mL ONPG底物溶液于對照液中，渦旋混合均勻。從每個試管取200 μL溶液于微孔板中，每支試管樣品做3 次平行，使用Thermo Multskan Go全自動酶標儀在420 nm波長處精確測量樣品和對照液的吸光度。

1.3.4 包膜實驗

配制5%的Alg及6%的羧甲基CMP溶液。采用4 個不同體積比（Alg∶CMP=1∶0、1∶1、2∶1、3∶1）Alg-CMP多糖混合液與50 mg負載后的SECs均勻混合。使用1 mL的針筒逐滴加于50 mL、0.05 mol/L的CaCl2溶液均勻攪拌后，靜置10 min后真空抽濾，超純水洗滌3 次后，得到硬化后的凝膠球。

1.3.5 體外釋放實驗

將不同比例Alg-CMP體系（Alg∶CMP=1∶0、1∶1、2∶1、3∶1）制成的凝膠球加入模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF，pH 2.5），放入恒溫搖床37 ℃、100 r/min孵育2 h。收集凝膠球，水洗后加入模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF，pH 7.4），37 ℃、100 r/min恒溫搖床孵育6 h。固定時間下取出均勻混合的樣品液1 mL，測量其在420 nm波長處的吸光度。同時取錐形瓶，加入未經包膜處理的負載乳糖酶的SECs（乳糖酶質量相同），按照上述相同條件，固定時間下取出均勻混合的樣品液1 mL，測量其在420 nm波長處的吸光度，作為對照組。

1.3.6 凍干保護效果評價

羧甲基CMP具有優良的特性，常作為凍干制劑中蛋白質的賦形劑。因此將乳糖酶液和Alg-CMP體系制備的凝膠球進行凍干處理后測其酶活力，由此驗證Alg-CMP體系是否具備成為乳糖酶凍干保護劑的潛力。酶活力損失率計算如下：

1.4 數據分析

各組實驗均進行3 次平行測定，數據分析采用Excel軟件，結果表示為±s。作圖采用Origin Pro 8.5。

2 結果與分析

2.1 SECs的制備與表征

向日葵花粉為單腔花粉，在去除其致敏內容物，較大空腔為藥物及營養素的包埋提供了充足的負載空間。依據實驗室對向日葵孢粉素的前期研究可得[25]，其脫脂10 h后經過不同時間的磷酸酸解處理，得到SECs。SECs通過粒徑測定、形貌分析及C、N元素分析等一系列表征，表明經磷酸處理后，其內容物去除程度不斷提高，致使其內腔中空程度顯著增大。研究發現，在酸解處理10 h后，其內腔較大，同時SECs形態結構保持完整。因此本實驗采用磷酸處理10 h后的向日葵SECs作為目標遞送載體。

由圖1a、b對比可知，經脫脂和酸解處理后向日葵孢粉素中內容物被去除，SECs內腔的中空程度得到了較大提高，為負載乳糖酶提供了充足空間。SECs的掃描電子顯微鏡切面圖進一步證明了向日葵SECs內容物被充分去除（圖1c）。從圖2可以清晰觀察到，向日葵孢粉素外壁具有微米級大孔和納米級小孔，可實現乳糖酶的負載。從上述形貌特征可知，向日葵SECs表面具孔，同時其內腔大、粒徑分布均一，是實現乳糖酶高效負載的優異載體。

圖1 向日葵SECs激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡圖像Fig.1 CLM and SEM images of SECs

圖2 脫脂和酸解處理后向日葵SECs掃描電子顯微鏡圖像（×30）Fig.2 SEM images of defatted SECs and acid treated SECs (× 30)

2.2 β-半乳糖苷酶負載

基于實驗室前期研究[25]，本實驗采用真空負載技術實現乳糖酶的負載。實驗發現在SECs與β-半乳糖苷酶質量比50∶1，負載溫度30 ℃、負載3 h條件下，向日葵SECs的酶活力保留率高達（85.40±1.19）%。圖3是采用FITC熒光標記的乳糖酶負載前后向日葵SECs的激光共聚焦顯微鏡圖（激發片波長460～550 nm，發射片波長590 nm）。對比圖3可看出，熒光標記的乳糖酶已被成功負載于向日葵SECs內，進一步說明向日葵SECs可作為乳糖酶的優良的載體。但由于向日葵SECs表面存在大小孔，雖然為乳糖酶的負載提供了通道，但是前期實驗驗證發現多孔的結構使其不能在胃環境下提供對乳糖酶的保護。因此需要在負載乳糖酶后，使用高聚物包埋技術進一步實現對花粉大小孔的包埋，同時可利用高聚物的性質賦予體系一定的環境相應性。

圖3 熒光標記的乳糖酶負載前（a）和負載后（b）向日葵SECs激光共聚焦顯微鏡圖Fig.3 CLM images of free SECs (a) and SECs loaded with fluorescent labeled β-Gal (b)

2.3 體外模擬實驗

2.3.1 微球形貌

本實驗選擇使用Alg與Alg-CMP體系實現對花粉大小孔的包埋。圖4顯示，Alg凝膠球在SGF中模擬消化2 h后，其形態結構與0 h相比并未有較大變化，仍是球體。從形態上分析，這有利于保護乳糖酶在胃液環境中不受破壞，保持其活性。在SIF消化的過程中，凝膠球慢慢溶解，這表明乳糖酶在腸液環境中可被緩慢釋放，顯示出一定的釋放靶向性。

圖4 Alg凝膠球在SGF和SIF中的溶出過程照片Fig.4 Photographs displaying the dissolution process of ASG in SGF and SIF

從圖5可得，Alg與CMP混合（體積比1∶1）所制的凝膠球在SGF和SIF中的變化情況類似Alg凝膠球。在SGF中孵育2 h后，其形態結構與初始相比并未有顯著變化，這表明加入CMP后的凝膠球同樣具備保護乳糖酶在胃酸環境下不被破壞的特點。之后在SIF消化過程中，凝膠球逐漸溶解，這表明加入CMP并不影響乳糖酶在腸液中的響應性釋放。

圖5 Alg-CMP凝膠球在SGF和SIF中的溶出過程照片Fig.5 Photographs displaying the dissolution process of Alg-CMP in SGF and SIF

2.3.2 掃描電子顯微鏡分析

從圖6可知，初始狀態，SECs可包裹在Alg凝膠中，SGF孵育2 h后，凝膠結構部分松散，但仍可看出凝膠可黏附在SECs外。這進一步說明了該體系具備一定的保護乳糖酶抵抗胃環境的能力。SIF中凝膠球隨著模擬消化時間的延長逐漸溶解，乳糖酶被釋放于腸液中發揮作用。從圖7可知，在經過胃環境孵育2 h后，凝膠結構基本無變化，SECs仍緊密包裹于凝膠網絡中。推測Alg與CMP間的相互作用可以一定程度增強凝膠強度，從而可以為負載有乳糖酶的SECs提供更強的保護。負載有乳糖酶的SECs在經過不同包膜材料處理后，其在SIF中的酶活力保留率將進一步驗證。

圖6 Alg凝膠球在SGF和SIF中溶解過程掃描電子顯微鏡圖Fig.6 SEM images displaying the dissolution process of ASG in SGF and SIF

圖7 Alg-CMP凝膠球在SGF和SIF中的溶解過程掃描電子顯微鏡圖Fig.7 SEM images displaying the dissolution process of Alg-CMP in SGF and SIF

2.3.3 體外釋放

實驗顯示，僅使用向日葵SECs負載乳糖酶，未進行表面聚合物包埋，該體系測得乳糖酶基本全部失活（對照組，結果未顯示），表明SECs上大小孔雖然可實現對乳糖酶的負載，然而其未能在胃部的強酸環境中對乳糖酶提供高效保護。因此，需要Alg或Alg-CMP體系實現對花粉大小孔的包埋。如圖8所示，在SIF中孵育4 h后釋放基本達到平衡。其中僅使用Alg制備的微球中乳糖酶活力保留率最低，對乳糖酶的保護效果不理想。這可能是由于Alg形成微球的空間網絡狀結構較疏松，導致其在SGF環境中H+對乳糖酶活力產生了破壞作用[26]。而加入CMP后，在經過SIF消化4 h后酶活力顯著提高，尤其是Alg與CMP溶液體積比為1∶1時，其酶活力保留率最高，約55%，對乳糖酶起到明顯的保護作用。這可能是由于加入CMP后，凝膠球形成的空間網絡狀結構更為致密，從而可以抵抗胃環境達到對乳糖酶活性更好的保護效果，這與掃描電子顯微鏡分析結果可以相互驗證。關于CMP與Alg間的相互作用力影響凝膠結構，進而影響酶活力保留率的原因，據推測可能與兩種多糖的結構具有一定關系。Alg結構中含有大量羧基，是一種陰離子多糖也是酸性多糖，其結構上的Na+可以與Ca2+發生離子交換，快速形成水凝膠[27]。CMP是β-吡喃糖苷鍵結合的多糖，也是一種陰離子多糖，據王博等[28]研究發現，CMP的分子鏈構象與糖溶液的濃度、溶劑性質及離子強度密切相關，不同物化性質的溶液都會對其分子鏈的構象產生很大影響。從結構方面看，這兩種多糖結構較為相似，因此具有較好的生物相容性[29]。這兩種多糖分子中含有大量羥基和羧基，分子間可通過范德華力作用形成物理交聯使得分子之間的作用力增加，從而使得凝膠球的網狀結構更為致密[30]，起到一定的緩釋效果，這與圖8結果也吻合。綜上可知，Alg與CMC溶液體積比為1∶1時所制備的凝膠球對乳糖酶的保護效果最佳。

圖8 包膜后SECs外模擬累積釋放圖Fig.8 In vitro simulated cumulative release of β-Gal from SECs after capsulation

2.4 凍干保護

真空冷凍干燥技術應用廣泛，尤其在食品、生物、醫藥等多種領域[31]。酶制劑經過冷凍干燥技術處理后可延長其儲存性能，有利于對其活力的保持[31]。但是對于穩定性較差的酶制劑如乳糖酶，經冷凍干燥后，可一定程度損失其活性。因此可開發具有優良冷凍保護效果的體系，最大化減小冷凍條件對酶活力的不利影響。由表1可知，經Alg-CMP體系保護的乳糖酶凍干后經過SIF釋放的酶活力高于純酶液，因此該體系具有作為乳糖酶凍干保護劑的能力。其保護機制可能是因為SECs物理和化學性質穩定，具有良好的抗高溫高壓等特性。通過SECs堅硬的外殼對乳糖酶進行封裝，相當于乳糖酶抵抗外界不良環境的天然屏障，極大增強了乳糖酶對外界不利環境的抗性。之后通過多糖體系將花粉上的微孔包封，一方面是進一步增強其抗性，另一方面是在包封過程中，由于蛋白質分子內存在大量的氫鍵，而多糖類化合物含有大量的自由羥基，它們之間相互結合將蛋白質分子牢牢地束縛在花粉之中，從而保護了蛋白質分子在冷凍干燥過程中不變性，進而起到保護乳糖酶活性的作用[31-32]。綜上所述，Alg-CMP體系具有作為乳糖酶的凍干保護劑的潛力。

表1 經SIF消化6 h后凍干乳糖酶與凍干Alg-CMP體系中乳糖酶活力損失率Table 1Enzymatic activity loss percentage of freeze-dried β-Gal and freeze-dried β-Gal in Alg-CMP system after 6 h incubation in SIF

3 結 論

將向日葵花粉經過一系列處理后采用真空負載技術可實現對乳糖酶的高效負載。但是由于向日葵SECs表面的大小孔，需要進一步對SECs進行包膜處理。包膜實驗采用4 個不同比例的Alg與CMP多糖體系（Alg∶CMP=1∶0、1∶1、2∶1、3∶1），與負載后的SECs均勻混合后制備凝膠球。在體外模擬消化實驗中，通過形貌圖以及掃描電子顯微鏡圖可以驗證Alg-CMP凝膠球在模擬消化釋放時，在SGF中基本不變，在SIF中凝膠溶解。體外消化釋放圖也進一步證實凝膠球在SIF消化過程中乳糖酶在逐步釋放，在4 h左右基本釋放達到平衡。同時結果顯示Alg-CMP微球（體積比1∶1）可以有效阻止乳糖酶過胃失活，實現在腸道中的響應性釋放，最大化保存酶活性。實驗還發現，Alg-CMP體系負載的乳糖酶在凍干處理后具有高效保護乳糖酶的效果，體系具備成為乳糖酶凍干保護劑的潛力。通過對向日葵SECs遞送體系的構建及后續實驗，成功論證了其可以作為乳糖酶高效遞送及保護載體的可行性，為乳糖不耐癥的治療提供了新的思路和想法。