調味香料蓽茇精油中清除游離基活性成分的快速篩選

王 嬋，李 榮,，吳 楊，王 穎，湯書華，譚 津，姜子濤,3,

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津埃文森科技有限公司，天津 300384；3.天津天獅學院食品工程學院，天津 301700）

蓽茇（Piper longumL.）系胡椒科胡椒屬植物蓽茇的干燥近成熟或成熟果穗[1]。國內主產于云南、廣西、廣東和福建等地。蓽茇作為調味香料，常與白芷、豆蔻、砂仁等配合使用，可用于食品的增香和除去異味，對去除動物性原料如牛羊肉的腥臊味特別有效；蓽茇與桂皮、陳皮配合，可降低或改善食物的苦味。蓽茇精油（essential oil fromP.longumL.，EOPL）及生物堿類化合物為蓽茇的主要有效成分，蓽茇具有抗胃潰瘍、抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤、降血脂、防治膽結石等作用[2-5]；關于蓽茇的化學成分，迄今關于生物堿的研究較多；EOPL僅有少量報道[6-8]，EOPL的主要成分為大根香葉烯和石竹烯等。鑒于EOPL具有一定的抗氧化[9-10]、抗炎和抗菌[11]活性，且不同產地、不同提取方法會使EOPL成分產生一定的差異，有必要對EOPL的成分進行進一步研究。

精油大多是由萜烯及萜烯類含氧衍生物構成的，因此精油具有一定的清除自由基即抗氧化活性。評價精油清除自由基活性的方法一般采用體外抗氧化活性法，其包括化學法[12-14]和細胞抗氧化法[15-17]。這些方法雖然簡單易行，但只能用于評價精油的總體抗氧化活性，卻無法測定精油中每一個成分清除自由基及抗氧化活性的大小。本實驗采用超快速氣相色譜電子鼻（gas chromatography-based electronic nose，GC-E-nose）技術[18-19]快速鑒定EOPL的化學成分，并與氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析結果進行比較；利用GC-E-nose結合化學抗氧化法，無需費時費力的單體分離過程，直接對所有EOPL成分清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）陽離子自由基和羥自由基的活性進行評價，并從分子結構的角度闡明EOPL成分的抗氧化機理，建立EOPL成分結構與抗氧化活性之間的構效關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓽茇樣品購自四川，粉碎后過篩備用；C6～C16正構烷烴標準混合物 法國Alpha MOS公司；C8～C40正構烷烴標準混合物 美國AccuStandard公司；DPPH、ABTS、過硫酸鉀（K2S2O8） 美國Sigma公司；無水硫酸鈉、無水乙醇和硫酸亞鐵等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Heracles II電子鼻、MTX-5超快GC色譜柱（10 m×0.18 mm，0.4 μm） 法國Alpha MOS公司；Trace 1310 TSQ 8000 Evo GC-MS聯用儀、TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Thermo Fisher公司；Multisynth微波反應器 意大利Milestone公司；Lambda 25紫外-可見分光光度計 美國PerkinElmer公司；AUY120萬分之一電子天平 日本島津公司；FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EOPL的提取

稱取適量蓽茇粉末，放入超聲-微波反應器的提取瓶中，以蒸餾水為提取劑，采用單因素試驗對植物組織破碎和EOPL提取條件進行優(yōu)化，在最佳破碎條件（微波功率700 W、微波溫度95 ℃、微波時間3 min）和最佳提取條件（微波功率500 W、微波溫度95 ℃、料液比1∶10（g/mL））下提取EOPL，得到的EOPL經無水硫酸鈉干燥后，用0.22 μm有機濾膜，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 EOPL化學成分分析

1.3.2.1 GC-E-nose鑒定EOPL化學成分

取一定量待測樣品于頂空瓶中，GC-E-nose色譜柱MTX-5（10 m×0.18 mm，0.4 μm），捕集阱溫度40 ℃，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度250 ℃，采集時間215 s，采用程序升溫：以1 ℃/s升溫速率由50 ℃（初始等溫時間2 s）升到250 ℃（維持10 s），以氫氣作為載氣。以C6～C16正構烷烴標準溶液為參比測定出EOPL中每一個化合物的保留指數，再通過GC-E-nose Arochembase數據庫檢索，確定EOPL的化學成分。

1.3.2.2 GC-MS鑒定EOPL化學成分

參照文獻[20]中的GC-MS條件稍作改進。TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，以2 ℃/min升溫至180 ℃，以20 ℃/min升溫至280 ℃，最后280 ℃恒溫10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣量0.4 μL；分流比60∶1。電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度260 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z50～450。

以C8～C40正構烷烴標準溶液為參比測定化合物的保留指數。利用系統自帶的Mainlib Library和Replib Library質譜數據庫檢索，并結合保留指數對EOPL化學成分進行定性，確認EOPL的化學成分。

1.3.3 GC-E-nose篩選清除自由基活性成分

1.3.3.1 清除DPPH自由基活性成分

取500 μL 10.0 mg/mL EOPL乙醇溶液和等體積10 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，室溫下避光反應30 min為實驗組；另外，相同條件下以等體積無水乙醇代替DPPH溶液作為對照組，按照1.3.2.1節(jié)進行GC-E-nose分析。以EOPL各組分與DPPH溶液反應前后峰面積變化[21-22]計算清除率，以表征EOPL各組分對DPPH自由基的清除活性強弱。清除率按式（1）計算：

式中：A0為對照組EOPL各成分峰面積，即未與自由基反應的各成分峰面積；Ai為實驗組EOPL各成分峰面積，即與自由基反應后剩余的各成分峰面積。

1.3.3.2 清除ABTS陽離子自由基活性成分

將7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8等體積混合，用無水乙醇稀釋10 倍為ABTS工作液。取500 μL EOPL乙醇溶液（10 mg/mL）和500 μL ABTS工作液，室溫下避光反應30 min為實驗組。另外，以等體積的乙醇溶液代替ABTS工作液作為對照組，進行GC-E-nose分析，以各成分峰面積變化計算清除率，以表征EOPL各組分對ABTS陽離子自由基的清除活性強弱。清除率按式（1）計算。

1.3.3.3 清除羥自由基活性成分

將250 μL FeSO4溶液（1.0 mol/L）、500 μL EOPL乙醇溶液（10 mg/mL）以及250 μL H2O2溶液（15%）混合均勻后于室溫避光反應30 min為實驗組。另外，以等體積的除氧蒸餾水代替FeSO4溶液和H2O2溶液作為對照組，進行GC-E-nose分析。以各成分峰面積變化計算自由基清除率，以表征EOPL各組分對羥自由基的清除活性強弱。清除率按式（1）計算。

2 結果與分析

2.1 EOPL的GC-E-nose鑒定結果

如表1、圖1所示，GC-E-nose所用的檢測器為氫火焰檢測器（hydrogen flameionization detector，FID），而GC-MS所用的檢測器為質譜檢測器，后者的靈敏度比FID高。由于檢測器的不同和靈敏度的差異，GC-E-nose檢測出EOPL共34 種成分，占精油總量的87.8%，主要成分為大根香葉烯（26.04%）、石竹烯（13.57%）、順式-茴香腦（8.87%）及β-甜沒藥烯（7.32%）。GC-MS檢測出39 種成分，占精油總量的91.6%。GC-E-nose與GC-MS檢測有34 種成分一致，兩者符合度達89.7%。另外，GCE-nose同樣具有強大的數據庫比對功能，且其檢測時間用時較短，一般只需200～300 s，比GC-MS快14 倍，說明采用GC-E-nose對揮發(fā)性成分進行快速定性分析可行，與GC-MS對比檢測速率有明顯的優(yōu)勢。

圖1 EOPL的GC-E-nose色譜圖（A）與GC-MS總離子流圖（B）Fig.1 GC-E-nose chromatogram (A) and GC-MS (B) total ion current chromatogram of EOPL

2.2 清除自由基活性成分的識別

2.2.1 清除DPPH自由基活性成分的識別

如圖2和表2所示，EOPL中有12 種成分對DPPH自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為順式-茴香腦＞大根香葉烯＞反式-肉桂酸甲酯＞桉葉油醇二烯＞十五烯＞石竹烯＞α-金合歡烯＞氧化石竹烯＞反式羅勒烯＞β-甜沒藥烯＞蛇麻烯氧化物。其中順式-茴香腦和大根香葉烯表現出很強的DPPH自由基清除活性，清除率分別為78.1%和67.9%。

圖2 EOPL清除DPPH自由基的GC-E-nose色譜圖Fig.2 GC-E-nose chromatogram showing EOPL’s scavenging capacity against DPPH radicals

表2 EOPL活性成分對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基及羥自由基的清除能力Table 2 DPPH radicals, ABTS cation radicals and hydroxyl radicals Scavenging capacity of bioactive components in EOPL

在清除DPPH自由基較強的化合物中，共同點是多數化合物中均含有碳碳雙鍵（C＝C），C＝C導致其鄰位碳上的α-H較活潑，使C—H鍵易斷裂發(fā)生H原子轉移（hydrogen atom transfer，HAT）反應[23]，H與DPPH自由基結合生成穩(wěn)定的DPPH—H。大根香葉烯含有多個C＝C，在3、4號位點上的碳氫鍵更容易斷裂，其α-H也較多，在傳遞H時，多位點均可以傳遞H原子，相比較而言共軛體系[24-25]中的C＝C更容易給出H原子，因此大根香葉烯表現出較強的清除DPPH自由基活性。而順式-茴香腦清除DPPH自由基活性最強，可能是因為其結構中除了含有活潑的α-H同時還含有醚鍵（—C—O—C—）不穩(wěn)定，在乙醇溶液中水解為醇羥基，O—H極性較強，容易斷裂，鍵斷裂后也可以提供H，通過HAT與DPPH自由基上的電子結合而生成DPPHH。清除DPPH自由基的機理如圖3所示。

圖3 清除DPPH自由基反應機理Fig.3 Mechanism for scavenging of DPPH radicals

2.2.2 清除ABTS陽離子自由基活性成分的識別

如圖4和表2所示，EOPL中有10 種成分對ABTS陽離子自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為氧化石竹烯＞十五烯＞石竹烯＞大根香葉烯＞順式-茴香腦＞α-金合歡烯＞β-甜沒藥烯＞蛇麻烯氧化物＞乙酸冰片酯＞反式羅勒烯。其中氧化石竹烯與順式-茴香腦對清除ABTS陽離子自由基均有很強的活性，清除率為87.0%和77.1%。

圖4 EOPL清除ABTS陽離子自由基的GC-E-nose色譜圖Fig.4 GC-E-nose chromatogram showing EOPL’s scavenging capacity against ABTS cation radicals

氧化石竹烯與順式-茴香腦結構中均含有醚鍵（—C—O—C—），反應機理分為3 步，第1步，—C—O—C—不穩(wěn)定，在醇溶液中，醚鍵斷裂生成醇羥基，醇羥基電離出H+生成了氧負離子；第2步，氧負離子提供一個單電子與ABTS陽離子自由基上的單電子結合[26]；第3步，電離的H+與氮上的共用電子對結合，生成穩(wěn)定的ABTSH。清除ABTS陽離子自由基的反應機理主要是通過質子優(yōu)先損失電子轉移機制[27]，反應機理如圖5所示。

圖5 清除ABTS陽離子自由基反應機理Fig.5 Reaction mechanism for scavenging of ABTS cation radicals

2.2.3 清除羥自由基活性成分的識別

如圖6和表2所示，EOPL中有21 種成分對羥自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為右旋萜二烯＞反式羅勒烯＞β-蒎烯＞左旋樟腦＞α-蒎烯＞芳樟醇＞α-香柑油烯＞順式-茴香腦＞丁香酚＞古巴烯＞大根香葉烯＞反式-肉桂酸甲酯＞桉葉油醇二烯＞花柏烯＞十五烯＞β-甜沒藥烯＞氧化石竹烯＞乙酸冰片酯＞十六醛＞石竹烯＞β-金合歡烯。其中右旋萜二烯、反式羅勒烯和β-蒎烯對清除羥自由基的活性較高，清除率分別為71.6%、67.8%和66.6%。

右旋萜二烯、反式羅勒烯、β-蒎烯結構中均含有雙鍵，研究表明，萜烯類和倍半萜烯類化合物和烯烴化合物含有雙鍵，可以加成羥自由基形成二級基團，因此表現出較好的羥自由基清除能力[28]。在與羥自由基發(fā)生加成反應，自由基對α-烯烴的加成方向總是優(yōu)先選擇末取代端[29-30]，因此右旋萜二烯中1、2號位的雙鍵容易與羥自由基加成，同理反式羅勒烯的5、6號位與β-蒎烯中的1、2號雙鍵易發(fā)生加成反應。清除羥自由基的機理如圖7所示。

圖7 清除羥自由基反應機理Fig.7 Mechanism for scavenging of hydroxyl radicals

3 結 論

采用GC-E-nose鑒定EOPL的化學成分，與GC-MS的檢測結果相比，符合度高達89.7%。此結果表明，GC-E-nose用于精油等揮發(fā)性成分的結構鑒定切實可行。而且整個定性過程僅需要200～300 s，以現有其他技術手段難以實現。采用GC-E-nose結合化學法對復雜的精油樣品中每一個化學成分其清除自由基和抗氧化活性進行評價，沒有涉及到費時費力的單體分離過程。并從分子的角度對清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的反應機理進行理論解釋，揭示不同化合物清除自由基的活性差異，不同自由基其清除機理也不同；建立EOPL的化合物結構與抗氧化活性的構效關系。本研究為從復雜混合物中快速篩選和評價生物活性成分提供了一個較優(yōu)的解決思路。