穩定同位素內標GC-QqQ-MS/MS法測定葡萄中33 種農藥殘留及其污染特征分析

鐘浩文，楊國順，陳文婷，白 描，譚 君

（湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128）

葡萄在全球食品消費中占據著非常重要的市場地位[1]。據統計，2014年全球葡萄產量估計為7 370萬 t，其中歐洲占41%，亞洲占29%，美洲占21%[1-2]。在葡萄的生產過程中，農藥被廣泛應用于控制和防治病蟲害，以增加作物產量；尤其是葡萄園中最常見的真菌病害，如白粉病、霜霉病和灰霉病等[3]。某些情況下，在葡萄園中如果農藥施用不規范，將會造成葡萄果實內或果皮上的農藥殘留超標[4]。除了較大的環境風險之外，高濃度的農藥殘留會影響葡萄及其加工制品的品質，并最終造成對消費者的健康危害。因此，監測并控制葡萄中的農藥殘留勢在必行。

當前國內外有關食品中農藥最大殘留限量（maximum residue levels，MRLs）的法規中[5-6]，明確規定了葡萄果實中的農藥殘留允許標準，不同農藥物質的MRLs值在0.01～5.00 mg/kg之間[2,5]。目前應用于食品中農藥殘留檢測的經典儀器方法為氣相色譜法和液相色譜法[7-8]，但其對于不同類型農藥的同時分析能力較弱；而質譜方法由于具有選擇性強、靈敏度高的特點，被廣泛應用于構建同時分析不同類型農藥的多殘留檢測方法[9-12]。各項國際法規標準也推薦使用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用或液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用的方法，檢測葡萄中的農藥殘留量[13-14]。2007年美國分析化學家協會的官方推薦儀器檢測方法[15]，同樣為GC-MS或LC-MS方法。

三重四極桿串聯質譜（triple quadrupole tandem mass spectrometry，QqQ-MS/MS）法作為一種升級的質譜檢測方法受到廣泛關注。QqQ-MS/MS采用選擇性的多反應監測（multi-reaction monitoring，MRM）數據采集模式，通過降低色譜的化學噪音，減小甚至消除基質干擾，可大大降低方法的檢出限（limits of detection，LOD）[2,11,16-24]。但是在實際應用中，由于葡萄生產中所施用的農藥多為小分子化合物，在電子電離（electron ionization，EI）的方式下，很難找到滿足QqQ-MS/MS要求的合適離子對，或者離子對豐度較低，或者離子對數量較少，從而影響農藥目標物定性與定量分析的準確性[2,17,25]。

本實驗開展農藥目標物的質譜裂解行為研究，探索特征碎片離子的微觀化學結構及其二次質譜碎裂的機理，挖掘合適的MS/MS分析離子對。此基礎上構建了GC-QqQ-MS/MS MRM的穩定同位素內標定量分析方法，有效降低基線噪音、增強分析靈敏度（LOD較之前文獻報道的GC-MS方法[9-10,12,14-15]低1～2 個數量級）、避免出現假陽性結果。以穩定同位素全氘標記物作為定量的內標物質，以期有效避免樣本基質中可能存在內標物質干擾峰，造成定量計算結果偏差較大的風險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄樣品由湖南省各地區的葡萄種植戶（葡萄園）提供，包括夏黑和陽光玫瑰2 個市場主流品種。

正己烷（農藥殘留級）、甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、二氯甲烷（色譜級） 百靈威科技有限公司進口分裝；甲苯（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；丙酮（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Cleanert S C18萃取小柱（2 g/12 mL）、Cleanert NH2氨基萃取小柱（500 mg/3 mL）、Cleanert PestiCarb活性炭萃取小柱（500 mg/6 mL） 北京艾杰爾科技有限公司。

腈菌唑（98.5%）、啶酰菌胺（99%）、烯酰嗎啉（98%）、烯唑醇（99.5%）、氟硅唑（1.00 mg/mL）、腐霉利（96.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氰菊酯（100 μg/mL）、百菌清（98%）、戊唑醇（95%）、霜霉威（99%）、嘧霉胺（100 μg/mL）、抗蚜威（100 μg/mL）、撲海因（100 μg/mL）、唑菌胺酯（100 μg/mL）、腈嘧菊酯（100 μg/mL）、丙森鋅（100 μg/mL）、氟蟲腈（98%）、抑霉唑（97%）、氟氰戊菊酯（1 000 mg/L）、苯醚甲環唑（98%）、戊菌唑（95%）、毒死蜱（99%）、噻嗪酮（99%）、三氟氯氰菊酯（98%）、噠螨靈（99%） 美國AccuStandard?Inc.公司；S-氰戊菊酯（99%）、溴氰菊酯（99.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；殺蟲環（100 μg/mL）、久效磷（100 μg/mL）、乙拌磷（100 μg/mL）、對硫磷（100 μg/mL） 農業部環境與保護監測所；全氘代間三聯苯（p-terphenyl-D14，TPh-D14，98%） 美國Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000C氣相色譜-串聯質譜儀（配備7693自動進樣器） 美國Agilent公司；XW-80A旋渦混合器江蘇海門其林貝兒儀器有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FJ-200均質器上海標模有限公司；HSE-12B固相萃取儀 天津恒奧科技發展有限公司；XD-200A旋轉蒸發儀 上海賢德實驗儀器有限公司；NDK200-1氮吹儀 杭州米歐儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；MS105型電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

33 種農藥標準品中，將純品直接溶解于二氯甲烷配制成質量濃度為1 mg/mL的單一標準儲存溶液；液體溶液直接裝入儲存瓶中。移取適量的上述溶液于同一個容量瓶中，以二氯甲烷溶劑稀釋定容，配制成質量濃度為0.001 6、0.008 0、0.020 0、0.040 0、0.080 0、0.160 0、0.200 0 mg/L和0.320 0 mg/L的混合標準使用溶液，所有上述標準溶液于冰箱4 ℃保存備用。

1.3.2 樣品前處理

參考文獻[26]的方法，將葡萄果實樣品切碎、混勻、攪碎，準確稱取10.00 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2.5 g NaCl，再勻漿提取1 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，待凈化。

將上述10 mL提取液轉入用10 mL乙腈淋洗過的C18萃取小柱（2 g/12 mL），以15 mL乙腈洗脫，收集流出液真空濃縮至約1 mL，備用。在NH2氨基萃取小柱的頂部，串聯PesticiCarb活性炭萃取小柱（預填約2 cm高的無水Na2SO4），以4 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）混合溶液淋洗后，將前述濃縮液徹底轉移至NH2氨基萃取小柱，用25 mL乙腈-甲苯混合溶液（3∶1，V/V）洗脫，收集所有流出物于50 mL離心管中，真空濃縮至約0.5 mL，以正己烷進行溶劑置換后，加入5.00 μL質量濃度為1.00 mg/L的TPh-D14內標溶液，渦旋混勻，待GC-QqQ-MS/MS MRM分析。

1.3.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent HP-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持1 min，最后以2 ℃/min升溫至290 ℃保持0 min；進樣口溫度280 ℃；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；不分流進樣。

質譜條件：EI源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃。質譜數據采集方式：1）全掃描模式，質量掃描范圍m/z45～600；2）MRM。

2 結果與分析

2.1 QqQ-MS/MS MRM分析方法的建立

首先在EI離子化方式下，采用全掃描模式對農藥目標物的混合標準溶液實現基線分離，確定各目標物出峰的保留時間見表1。參考文獻[19-20]方法，調用美國國家標準與技術研究院質譜數據庫中所有目標物的標準質譜圖，結合全掃描標準溶液的實際質譜圖，挑選各目標物的前級母離子進行二次質譜裂解（表1）。再后，在遵循特征子離子挑選原則的基礎上（盡量選擇豐度較高，且保留對應化合物的特征基團結構），通過子離子掃描模式建立定性離子對與定量離子對（表1）。最后，進行各離子對的碰撞能量優化實驗，確定其最佳豐度情況下所對應的碰撞能量值，從而建立最優化的GC-QqQ-MS/MS MRM分析方法。經實驗證實，該方法基線噪音小、干擾少、信噪比高，對于農藥殘留檢測的選擇性好且靈敏度高。

表1 農藥目標物的基本理化學信息和鑒定特征Table 1 Chemical information about target pesticide compounds and MS/MS parameters for them

2.2 內標物質的選擇

內標定量方法能夠有效解決不同樣品基質對目標物響應的抑制或增強作用，提高定量的準確性[20]。采用內標法繪制的工作曲線，較外標工作曲線方法呈現更好的線性相關，其線性相關系數值更高。而本實驗方法所采用的穩定同位素內標物質，相對于食品安全國家標準方法[26]中推薦的環氧七氯內標物質，能夠更有效地避免由于樣品中本身存在此類物質而造成定量結果偏低的問題，故本實驗中以TPh-D14作為定量計算的穩定同位素內標物。

2.3 目標物的質譜裂解行為分析

建立MS/MS方法需要挑選具有較強特征性結構的前級母離子，即m/z較大且保留較完整官能團結構的碎片離子，以便于在進一步的二級質譜裂解過程中，挖掘具有特征性結構的碎片離子（子離子），構建目標物專屬的強選擇性的定性與定量離子對。然而，葡萄生產中所涉及的農藥目標物，除了擬除蟲菊酯類之外，絕大多數為小分子化合物（相對分子質量小于350）[2,17,25]，在EI方式下，很難保留其對應的分子離子等質量數較大（m/z較大）的碎片離子，造成二級質譜裂解離子對的選擇困難。

本實驗重點對二級質譜裂解中的子離子與母離子的碎裂機理進行解析，對特征碎片離子的結構歸屬進行探索，尋求適合MS/MS準確定性與定量分析的合適的離子對，為農藥化合物的質譜裂解行為研究（尤其是二級質譜乃至多級質譜裂解）奠定基礎。以氟蟲腈和咪鮮胺為例，如表1所示，氟蟲腈的二級質譜裂解前級母離子為m/z367的碎片離子，該母離子由其圖1a中的分子離子（m/z437.14）進行一級質譜裂解所得，進行二級質譜裂解則分別得到子離子m/z180、124，分別構建m/z367＞180的離子對作為定量計算；m/z367＞124的離子對作為輔助定性。同樣如圖1b所示，咪鮮胺的定性與定量分析離子對分別為m/z308的一級質譜碎片離子（母離子）進行二級裂解所得子離子m/z70和m/z85。

圖1 氟蟲腈（a）和咪鮮胺（b）的MS/MS碎片離子結構與二級質譜裂解機理Fig.1 Structures of MS/MS fragment ions from fipronil (a) and prochloraz (b) and mechanisms for their secondary mass spectrometric fragmentation

2.4 質量控制與方法學驗證

2.4.1 全過程空白

將等體積的超純水同1.3.2節進行樣品前處理，平行3 次，經GC-MS/MS檢測證實，如表2所示，在所有目標物出峰的時間段，不存在試劑空白的出峰干擾，該方法具有較強的專屬性，從而空白干擾少且定性準確。

表2 農藥目標物的方法空白、方法線性與范圍、儀器LOD、方法LOQ、加標回收率、RSD和國標規定MRLsTable 2 Calibration curve correlation coefficients, LOD, LOQ,recoveries and RSD for target pesticide compounds and maximum residue limits stipulated for them by Chinese national standard

2.4.2 線性與范圍

參考國標[6]對農藥目標物在食品中最大殘留限量的相關規定，重復3 次檢測如上1.3.1節較寬質量濃度范圍的混合標準使用溶液。由表2可見，在0.001 6～0.320 0 mg/L的質量濃度范圍內，該方法呈現良好的線性相關，其線性相關系數（R）不低于0.994 7。

2.4.3 方法靈敏度

依據國際純化學和應用化學聯合會對于LOD的定義，分別采用3 倍和10 倍信噪比計算儀器LOD和方法定量限（limit of quantification，LOQ），結果見表2。該方法的LOD和LOQ分別為0.064～40.000 μg/L和0.000 02～0.013 33 mg/kg，符合歐盟、美國、日本和中國等組織對于食品中農藥殘留分析的方法靈敏度要求。此外，食品安全國家標準方法[26]采用選擇離子監測法，對葡萄中的上述農藥進行定性與定量測定，其LOQ為0.012 6～0.300 0 mg/kg，而本方法采用QqQ-MS/MS方法，具有更低的LOQ，方法靈敏度更高、干擾少，且定性更可靠。

2.4.4 方法準確性

通過在葡萄樣品中添加農藥目標物的回收率實驗驗證該方法的準確性。如表2所示，高、中、低3 個不同添加水平（0.10、0.50 mg/kg和1.00 mg/kg），每個添加水平重復3 次，同樣進行樣品前處理后，經GC-MS/MS MRM檢測，分析各目標物的加標回收率。

表2證實，當加標量較低時（0.10 mg/kg）回收率在70.1%～94.7%之間；當加標量居中時（0.50 mg/kg）回收率在72.1%～109.8%之間；當加標量較高時（1.00 mg/kg）回收率在71.6%～120.6%之間。該方法的準確度較高，3 種不同添加水平的回收率結果均在70.1%～120.6%之間，且目標物的加標量越多回收率越高。目標物的損失均在可以接受的范圍之內，符合食品安全國家標準方法中[26]，對于水果和蔬菜中農藥測定的回收率結果要求。

2.4.5 方法重復性

計算不同添加水平葡萄樣品的回收率結果之間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以此統計該方法的精密度，并對其實驗室內重復性進行有效估計。由表2可見，該方法的加標回收率結果之間的RSD在3.3%～17.9%的范圍內，符合食品安全國家標準方法中[26]，對于水果和蔬菜中農藥測定的實驗室內重復性要求（精密度＜18%）。

2.5 葡萄樣品中的農藥殘留量分析

2.5.1 不同樣品的農藥污染水平

將所建立的方法應用于湖南地區不同葡萄園中的不同品種葡萄樣品分析，20 份葡萄樣品中有15 份樣品檢出農藥；而有檢出的農藥目標物為17 種，且殘留總量最高達2 451.8 μg/kg；但所有檢出的各項農藥目標物的殘留量均未超過我國的最大殘留限量規定[6]。檢出的農藥中殘留量最大的為撲海因、腈嘧菊酯和烯酰嗎啉，總檢出量分別為1 965.5、385.0 μg/kg和1 152.5 μg/kg；同時圖2中的統計結果證實，這3 種農藥的施用與當地葡萄樣品中的農藥殘留問題呈明顯正相關，應成為需要重點關注和嚴格控制的葡萄園農用藥品。

圖2 不同采樣點葡萄樣品中的關鍵性污染農藥Fig.2 The key contamination pesticides in grape samples at different sampling points

2.5.2 不同樣品的農藥殘留分布規律

在葡萄園生產過程中較常使用的農藥，在各地的葡萄樣品中均有檢出（圖3），如防治灰霉病的嘧霉胺、腐霉利和撲海因；用于浸果保鮮的抑霉唑；防殺蚧殼蟲的噻嗪酮；防治白腐病的戊唑醇；防治霜霉病的腈嘧菊酯和烯酰嗎啉等，可見葡萄園的農藥施用情況直接影響到葡萄果實中相關農藥的殘留情況。且由圖3可見，各種農藥目標物在不同葡萄樣品中的分布差異較大，尤其是撲海因、嘧霉胺、腈嘧菊酯和烯酰嗎啉的樣品分布差異顯著。在西部地區的葡萄樣品中，這4 種農藥的檢出量較多，充分說明該地區葡萄園中使用防治灰霉病或霜霉病的藥物較多，根本原因在于葡萄園的病害發生概率高還是農民濫用農藥所造成的，仍有待后續研究進一步考證。

圖3 各農藥目標物在葡萄樣品中的分布情況箱形圖Fig.3 Distribution of all target pesticides in grape samples

2.5.3 不同采樣區域的污染與分布特征

本實驗中葡萄樣品來源于湖南省東、南、西、北、中5 個區域，以當地的主要葡萄園作為采樣點，首先將每個葡萄樣品中檢測到的目標農藥濃度歸一化為其總濃度，然后對歸一化數據集進行偏最小二乘判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）[27-30]。在各采樣區域的PLS-DA評分圖（圖4）中，來自相同區域的葡萄樣品可聚為一塊，具有極為類似的農藥分布情況。

圖45 個區域葡萄果實樣品中農藥殘留的PLS-DA評分圖Fig.4 Score plots of PLS-DA for pesticide residues in grape samples collected from five major sampling sites in Hunan province

湘東區域的葡萄樣品僅有一個檢出有甲氰菊酯（4.43 μg/kg）和腈嘧菊酯（5.00 μg/kg），其他樣品均未檢出（低于方法LOQ）；其他不同區域的葡萄樣品均有不同種類的農藥殘留檢出，尤其是湘西地區葡萄樣品中農藥殘留量較高且品種較多。同時，由于撲海因的檢出量較高，湘南、湘西和湘中區域的葡萄樣品中的目標農藥分布與主成分1呈正相關。在湘北區域的葡萄樣品中，腈嘧菊酯相對含量較高，目標農藥分布與主成分1呈負相關。此外，撲海因是防治葡萄灰霉病的主要農藥，而腈嘧菊酯為防治葡萄霜霉病的主要農藥，由此獲得提示，在湖南省域內葡萄的灰霉病和霜霉病為主要的病蟲害類型，需要引起廣泛關注，而本地區的葡萄園中病蟲害防治需要進行進一步的合理用藥指導。

3 結 論

本實驗建立了葡萄果實中33 種農藥殘留同時定性定量分析的GC-QqQ-MS/MS方法，在優化MRM模式參數條件和解析目標物二級質譜裂解機制的基礎上，引入穩定同位素全氘標記物（TPh-D14）作為內標物質，有效排除復雜基質干擾、增強目標物響應信號、降低基線噪音，使目標物實現基線分離，大大提高了分析靈敏度（較國標方法高1～2 個數量級），從而獲得更加準確的定性與定量分析結果。該方法滿足國家標準方法中的所有規定指標[26]，如平行實驗、空白實驗、重復性、LOQ和回收率等，適用于葡萄果實和其他水果蔬菜等食品中痕量/超痕量的農藥殘留分析和有效控制。